当研究室では、Synechocystis sp.PCC 6803のグルコース耐性株であるWilliams株を用いて実験を行っているが、私は遺伝的に均一だと思われていたこの野生株が、光独立栄養条件、特に強光下でコロニーサイズの異なった二集団に分けられることを見出した。すなわち光独立栄養条件での生育は遅いが培地にグルコースを加えた光混合栄養条件下では良く生育するタイプ(WS株)と、光独立栄養条件での生育は良いが、光混合栄養条件下では厳しい生育阻害を受けるタイプ(WL株)である(図1)。これは二者間で、光順化に関する何らかの因子が異なっていることを意味する。そこでWL株の光混合栄養条件下での生育能を相補するゲノム断片を単離同定したところ、新規遺伝子の一塩基の違いがこのような表現型の違いを引き起こしていることが明らかになり、この遺伝子をpmgA(photomixotrophic growth)と名付けた(図2)。pmgAは204アミノ酸からなる23kDaのタンパクをコードしており、そのアミノ酸配列には既知の配列との高い相同性は認められなかったが、システイン残基が多いこと、二成分調節系のセンサータンパク質のG1,G2ボックスと相同性があるドメインを持つという特徴があった。pmgAの193番塩基はWS株ではシトシン、WL株ではチミンであり、それに従い翻訳産物の65番目のアミノ酸残基がそれぞれロイシン、フェニルアラニンとなっていた。これら2つの遺伝子型のどちらが正常な遺伝子産物をコードしているのか知るために、pmgAにスペクチノマイシン耐性カセットを挿入し遺伝子破壊株を作成した。この株はWL型とよく似た表現型を示し(図1)、正常なpmgA産物を持つのはWS型(以後野生株と呼ぶ)であることが明らかになった。pmgAには前後に近接したORFが存在しており、上流のORFは出芽酵母のエンド-エキソヌクレアーゼと相同性のある463アミノ酸からなるタンパクを、下流のORFは176アミノ酸からなる未知のタンパクをコードしていた。これらのORFの破壊も行ったが、破壊株の表現型は野生株に似ており、これらのORFがpmgAとは独立に機能していることが示唆された。以上の結果より、当研究室で維持している野生株中に、pmgA遺伝子中の一塩基の違いにより、光独立栄養条件で有利なタイプと光混合栄養条件で有利なタイプの二種類が生じていることが明らかになった。

図1 様々な培養条件下でのWS株、WL株、pmgA破壊株のコロニーサイズWS株(A、D、G)、WL株(B、E、H)、pmgA破壊株(C、F、I)を弱光(20Em^-2s^-1)で4日間(A、B、C)、強光(370Em^-2s^-1)で3日間(D、E、F)、グルコース添加培地(50Em^-2s^-1)で5日間(G、H、I)それぞれ培養した。

図2 WL表現型の相補DNA断片の制限酵素地図とpmgAの塩基及び推定アミノ酸配列pmgAの配列中にはWL株の変異部位、スペクチノマイシン耐性カセット挿入位置、G1、G2ボックスのモチーフを示した。

　次にpmgA変異株(WL株、遺伝子破壊株)の表現型をさらに詳細に調べた。まず、強光培養時の細胞の吸収スペクトルが、野生株とpmgA変異株で異なっていることを見出した。弱光条件下では全ての株が同様なスペクトルを示したが、強光条件下では620nmのフィコシアニンの吸収極大に対する678nmのクロロフィルaの吸収極大の相対比が野生株とpmgA変異株で異なっていた。そこで細胞当たりの色素含量を吸収スペクトルのピークの高さから算出し、弱光培養株を強光条件下に移したときの色素量変化を調べた。フィコシアニン、クロロフィルaとも強光条件で減少するのはすべての株に共通しているが、フィコシアニン量の変動は各株の間でそれほど違いがなく、pmgAの有無に影響されていなかった(図3B)。それに対し、クロロフィルaの変動には野生株とpmgA変異株で明らかな違いがみられる(図3A)。これは、強光シフト後6時間以降のクロロフィルaの蓄積量が、pmgA変異株でWS株を上回ることが原因であると考えられる。シアノバクテリアはアンテナクロロフィルタンパクを持たないため、クロロフィルa量の違いは反応中心量の違いを反映している可能性がある。そこで、77Kでの蛍光スペクトルを測定した。この方法では695nm付近をピークとする系II蛍光(F695)と725nm付近をピークとする系I蛍光(F725)の大きさを比べることにより、光化学系の量比を大まかに知ることができる。弱光と強光でのスペクトルを比較すると、野生株では弱光条件に比べ強光条件で系IIの割合が相対的に大きく増加していた。pmgA変異株ではその増加はわずかであった(図4A)。図6と同じ条件でF695/F725比の時間変化をプロットすると(図4B)、野生株では強光シフト後12時間ほどで光化学系量比の変動が顕著になるのに対し、pmgA変異株では強光培養の全期間を通じてほとんど変動が起きていなかった。この事実は、光化学反応中心の直接的な定量(系II:チトクロムb₅₅₉量/2、系I:P700量)でも確認された(表1)。これまでに高等植物、緑藻、シアノバクテリア等で、強光条件下で光化学系Iが相対的に減少することが報告されているが、その分子機構は未だ全く解明されていなかった。以上の結果はpmgAがこの調節に特異的に関わっていることを強く示唆する。

図3 弱光(20Em^-2s^-1)から強光(200Em^-2s^-1)に移した際の色素含量変化(A)細胞当たりのクロロフィルa量の変化、(B)細胞当たりのフィコシアニン量の変化。●:WS、○:WL、□:pmgA破壊株を示す。横軸は弱光培養株を植えつぎ、強光下に移してからの時間を示す。増殖とともに被陰効果で実質的な光強度が下がり、色素含量が弱光レベルに戻っているのに注意。

図4 77Kでの細胞の蛍光スペクトル(A)各株の蛍光スペクトル。弱光(20Em^-2s^-1)の場合を点線で、強光(200Em^-2s^-1)の場合を実線で示した。スペクトルは725nmでノーマライズした。(B)弱光(20Em^-2s^-1)から強光(200Em^-2s^-1)に移した際のF695/F725の変化。●:WS、○:WL、□:pmgA破壊株を示す。横軸は弱光培養株を植えつぎ、強光下に移してからの時間を示す。

　次に弱光と強光での培養株の、炭酸固定を含めた光合成活性と光化学系の個別の電子伝達活性を飽和光下で測定した。一般に強光条件では、細胞当たりの炭酸固定活性はRuBPカルボキシラーゼの量や活性が増えるため増加し、光化学反応の活性は反応中心自体の量が減るため減少する。今回の測定でもその傾向はpmgAの有無に関わらず表れており、pmgAは特に炭酸固定系の光による増強には関与していなかった。さらに、強光培養株の活性を比較すると、全光合成、系II、系Iの全てでpmgA変異株の活性が野生株の活性を上回っており、このことが強光下でのpmgA変異株の増殖の速さの一因と考えられる。

　さらにRT-PCR法により、強光シフト後のpmgA転写産物の発現誘導を調べた(図5)。pmgA転写産物は弱光下でもわずかに発現しているが、強光シフト後4時間目に光化学系量比の変動に先だって大きく誘導されることが示された。

表1 弱光(20Em^-2s^-1)から強光(200Em^-2s^-1)に移した際の細胞当たり光化学系量、光化学系量比の変化弱光培養株を植えつぎ、強光下に移した時間を0hとした。この実験では図3、4の実験と培養スケールが異なるため光化学系量の変動が早目に起きており、WS株では13hですでに図4(B)の21hと同じF695/F725に到達していた。

図5 RT-PCRによるpmgA転写産物の発現解析弱光(20Em^-2s^-1)から強光(200Em^-2s^-1)に移した時間を0hとした。中段はポジティブコントロール、下段は逆転写前のRNAを鋳型に用いたネガティブコントロール。

　1章で示したように、pmgA変異株は研究室の野生株中にかなりの割合で存在していた。このことは、pmgAを介する順化機構が必須ではないことを意味するのだろうか?そこでまずこのような多型がいつ現れたのか知るために、過去に研究室で凍結保存していた野生株を分析した。ゲノムDNAを単離してpmgAをPCR増幅し、それを鋳型として用いるダイレクトシーケンス法と、強光下でのコロニーサイズを調べる方法を併用して多型の検出を行った。その結果、1995年6月以前に野生株からpmgAの一塩基変異株(WL株)が生じ、驚いたことに一年ほどの間に研究室の野生株を完全に駆逐してしまったという事実が明らかになった(図6)。次にpmgA遺伝子を持つことが、いかなる場合に有利または不利になるのかを様々な培養条件下で調べた。まず等量の野生株とWL株を混合し、200Em^-2s^-1の光のもと、光独立栄養条件と光混合栄養条件で培養して、ゲノムの量比が変動するかどうかダイレクトシーケンス法で調べた(図7)。光独立栄養条件の培養では、WLゲノムは植えつぐたびに徐々に増加した。それに対し、光混合栄養条件の培養では、WLゲノムは一回の培養で大きく減少し、さらに植えつぎ後にはダイレクトシーケンスの検出限界以下まで減少した。次に様々な光環境下での混合培養を同様に行った。予想どおりより強光でWLゲノムの割合が増えていったが、強光条件(200、300Em^-2s^-1)で、自己被陰を避けるために一日毎に植え継いだ場合には二回目の植えつぎ以降、急激な減少が起きているのが注目される(図8)。これはpmgA変異株は短期間の強光培養では良い生育を示すが、強光培養が長期間にわたると何らかのストレスが蓄積し、生存率が急速に低下することを示唆する。以上の結果からpmgA遺伝子は光混合栄養条件、および継続的な強光条件での生育に必須であることが示された。pmgAを介する順化機構は変動の激しい自然界で生き抜くために進化の過程で獲得されたものの、培養維持条件が常に光独立栄養、中光である研究室内では必須でなく、pmgA遺伝子に変異を起こしたため増殖能が改善されたWL株が野生株中で必然的に優占していったと考えられる。

図6 ダイレクトシーケンス法と強光下のコロニーサイズでみたWL株の野生株中での優占シーケンスの波形はpmgAの193番塩基とその近傍を表す。強光培養は370Em^-2s^-1で3日間行った。1996年3月のサンプルはDNAのみの保存。

図7 混合培養におけるWS株、WL株の増殖への培養条件の影響円グラフ中の灰色がWLゲノムの、白がWSゲノムの割合を示す。円グラフの右下には細胞濃度としてOD730の値を示した。点線部分は植えつぎ(500倍希釈)を示す。

図8 混合培養におけるWS株、WL株の増殖への光強度の影響円グラフ中の灰色がWLゲノムの、白がWSゲノムの割合を示す。円グラフの下には細胞濃度としてOD730の値を示した。点線部分は植えつぎを示す。