S.latifoliaの初期の蕾は両性の器官を持つが、蕾の成熟に伴って片方の性の生殖器官の発達が抑制され、雌雄の単性花が形成される。修士課程において、雌雄の生殖器官の分化様式を形態学的に解析するとともに、雄の蕾から作製したcDNAライブラリーを雌雄の蕾cDNAを用いてディファレンシャルスクリーニングを行うことにより、雄の蕾特異的に転写産物が蓄積するMRクローンを4個単離した。博士課程において、MRクローンをプローブにcDNAライブラリーを各12万プラークずつスクリーニングした結果、全長cDNAを単離できた3個のMRクローンについて塩基配列を決定し、MROS(male reproductive organ-specific genes)と命名した。開花直前期の蕾に転写産物蓄積が見られるMROS1は36アミノ酸からなる低分子量のタンパク質をコードしていた(図1)。発達後期の蕾に転写産物の蓄積が見られるMROS2は201アミノ酸からなるグリシンリッチプロテインを(図2)、花芽形成初期に特異的に転写産物が蓄積するMROS3は214アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた(図3)。

　さらに、MROS遺伝子の組織レベルでの発現様式を調べるために、雄の蕾のパラフィン切片に対して、ディゴキシゲニン標識したRNAプローブを用いたin situ hybridizationを行った。従来の明視野顕微鏡の代わりに改良暗視野顕微鏡を観察に用いることで、シグナルを鮮明な青紫色として検出できるようになった。MROS1は成熟花粉内で特異的に転写産物が検出された(図4)。MROS2転写産物は葯成熟開始時においては、葯壁や葯表皮に検出され、葯が裂開する口辺細胞付近に蓄積した。成熟が進むと葯壁における蓄積量は減少していくのに対して、花粉内の蓄積が増加した(図5)。さらに、開花直前期の葯内では成熟花粉特異的に転写産物の蓄積が検出された。このようにMROS2は異なる場所と異なる時期において葯成熟のために働くプライオトロピックな遺伝子であることが示唆された。MROS3転写産物は3mmの蕾内の葯のタペータム細胞に特異的に検出された(図6)。この時期はタペータム細胞が最も成熟することから、MROS3はタペータムの成熟に関与する遺伝子であることが示唆された。以上の結果から、MROS遺伝子は雄蕊の組織特異的に発現していることが明らかになった。

　MROS遺伝子をプローブにゲノミックサザン解析を行ったところ、MROS遺伝子は数本の雌雄DNA断片にハイブリダイズした。また、MROS遺伝子の配列から設計したSTS(sequence tagged site)プライマーを用いたPCRで、MROS遺伝子は雌雄両ゲノムに存在することを確認した。このことは、MROS遺伝子がY染色体特異的に局在していないことを示唆している。そこで、MROS3遺伝子の染色体上の詳細な局在位置を調べるために、fluorescence in situ hybridization法(FISH)を試みた。まず、cDNA塩基配列から逆向きに設計したプライマーを用いてinverse PCR法により2種類のMROS3遺伝子のゲノミッククローン(MROS3AとMROS3B)を単離した。従来のFISH法では数kbのlow copy 配列が検出限界であったが、アルカリフォスファターゼを介したHNPP/Fast Redカップリング増幅法を用いることで、MROS3遺伝子のシグナルが検出可能になった。さらに、常染色体を判別するためにrRNA遺伝子を混合したプローブを用いたマルチカラーFISHを行うことで、MROS3AとMROS3BをrRNA遺伝子を持たない3番と6番の中部動原体型常染色体上にマッピングできた(図7)。

　MROS遺伝子の雄性生殖器官に特異的な発現はY染色体上の遺伝子によって制御されていると推測される。しかし、現在までS.latifoliaの性染色体に局在する遺伝子は単離されておらず、性染色体構造も未解明である。そこで、レーザービームマイクロダイセクション装置でY染色体を直接単離し、Y染色体DNAの解析を試みた。まず、レーザー透過フィルム上にプロトプラスト化した細胞を展開し、染色体標本を作製した。次に、顕微鏡下の特定位置を記憶し、ステージとレーザーパルスを自動制御するソフトウェアLaser Sweeperを開発し、マイクロダイセクション装置と連動させることで、最適な染色体標本の周辺部位を数時間で自動的に昇華可能となった(図8)。さらに、回収した染色体をトポイソメラーゼI処理後、DOP-PCR法を用いて染色体DNAを増幅した。

　上記の方法により増幅したY染色体DNAをビオチン標識したプローブを用いてFISHを行ったところ、全染色体にハイブリダイズした(図9)。このことから、Y染色体DNAの大部分はX染色体および常染色体DNAと共通の配列であることが示唆された。

　マイクロダイセクションの解析により、S.latifoliaのY染色体は哺乳類のY染色体とは異なり、特異的な配列が蓄積していないことが示唆された。そこで、雌雄のDNA塩基配列の差からY染色体特異的断片を得るために、雌雄のゲノムDNAのRAPD解析を行った。43種類の10merのプライマーを用いて、雌雄のゲノムDNAを増幅したところ、2種類のプライマーから雄特異的DNA断片PYS(PCR amplified Y chromosome-specific fragments)が検出された。PYSクローンの塩基配列を決定した後、STSプライマーを設計しPCRを行ったところ、PYS1断片のみが雄ゲノム特異的に増幅した。そこで、PYS1-STSプライマーを用いてハプロイドのゲノムを持つ花粉一個の雌雄判定を試みた。Laser pressure catapulting(LPC法)を用いて回収した花粉一個からDOP-PCRによりDNAを増幅後、STSプライマーを用いたPCRを行った。雌雄両ゲノムに存在するMROS2のSTSが増幅した10個のサンプルのうち、4個のサンプルでPYS1の断片が観察された(図10)。S.latifoliaの性比は1:1であることから、PYS1-STSプライマーはY染色体特異的な配列を識別していると考えられる。

　また、PYS1を用いてFISHを行ったところ、すべての染色体にハイブリダイズした。しかし、検出条件を厳しくするとX染色体長腕動原体近傍部とY染色体動原体近傍部および中央部に強いシグナルが得られることがわかった(図11)。このことから、PYS1とホモロジーの高い配列は性染色体上に存在するが、PYS1に近い配列は性染色体を含めて染色体共通に分布していることがわかった。

図1 MROS1の遺伝子構造MROS1の転写産物は0.6kntであるが、塩基配列中に長いORFを持たない。最長の36アミノ酸からなるORFを示している。また、ゲノミッククローンの解析により、114番目の塩基後方(矢頭)に708bpのイントロンを持つことが明らかになっている。

図2 MROS2の遺伝子構造と推定タンパク質構造0.9kntの転写産物を持つMROS2は、201アミノ酸からなる21kDのタンパク質をコードしていた。このタンパク質のN末端側には疎水性残基が連っており、21アミノ酸からなる分泌様ペプチドシグナルと推定された(点線部位、矢頭は切断部位)。また、中央部分にグリシン残基が14残基連なっており(四角部位)、そのN末端側にGGKDGKからなるモチーフが3回繰り返されていた(矢印部位)。その後方には、エクステンシン様モチーフSPPPPが存在した(2重線部位)。下線部位はポリA付加シグナルを示す。

図3 MROS3の遺伝子構造と推定タンパク質構造1.4kntの転写産物を持つMROS3は、214アミノ酸からなる23kDのタンパク質をコードしていた。このタンパク質のN末端側は疎水性残基が連っており、23アミノ酸からなるペプチドシグナルと推定された(点線部位、矢頭は切断部位)。下線部位はポリA付加シグナルを示す。

図4 MROS1の成熟葯横断切片に対するin situ hybridization像成熟した葯に転写産物の蓄積が見られるMROS1のDIG標識アンチセンス(A)とセンス(B)RNAプローブを用いて、in situ hybridizationを行った。アンチセンスプローブを用いた時、花粉内の細胞質に特異的シグナル(青紫色)が得られた。大きい矢印は花粉壁から飛び出した細胞質を、小さい矢印は花粉壁内の細胞質を示す。バーは50mを示す。

図5 MROS2の葯横断切片に対するin situ hybridization像成熟した葯に転写産物の蓄積が見られるMROS2のDIG標識RNAプローブを用いて、葯横断切片に対するin situ hybridizationを行った。上記写真は葯の右下部分を示す。(a)から(d)はアンチセンスプローブを用いた結果を示す。(a)蕾の長さが5-10mmの時の葯においては、花粉(P)、葯壁(En)、葯表皮(E)にシグナルは検出されない。(b)蕾の長さが10-15mmの時の葯においては、葯壁部分に転写産物の蓄積が見出される。(c)蕾の長さが15-20mmの時の葯においては、葯表皮部分における蓄積量が増し、特に口辺細胞(S)周辺及び葯室支持組織(C)に特異的に蓄積する。(d)開花直前期の葯においては、葯壁部分の蓄積量は減少するが、花粉内の蓄積量は増大する。(e)開花直前期の葯に対してセンスプローブを用いた結果を示す。シグナルは検出されない。バーは50mを示す。

図6 MROS3の蕾縦断切片に対するin situ hybridization像初期の蕾に転写産物の蓄積が見られるMROS3のDIG標識RNAプローブを用いて、3mmの蕾縦断切片に対するin situ hybridizationの結果を示す。センスプローブの場合、雄の蕾(a)と葯内(d)にはシグナルは検出されないが、アンチセンスプローブの場合、雄の蕾の葯内にシグナルが観察され(b)、タペータム細胞に転写産物が蓄積していることがわかる(e)、雌の蕾(c)や分化が抑制された雄蕊(f)ではシグナルは観察されない。Aは葯、Lは子房室、Oは子房、Owは子房壁、Peは花弁、PIは胎座、Sは萼、Stは分化が抑制された雄蕊、Tはタペータム、Tdは花粉四分子を示す。(a)のバーは500m、(d)のバーは50mを示す。

図7 MROS3AとMROS3BのマルチカラーFISH像MROS3遺伝子のDIG標識プローブ(MROS3AとMROS3B)をG励起による赤色で、ピオチン標識rRNA遺伝子プローブをアピジン-FITCのB励起による黄色で、染色体をDAPIのUV励起による青色で検出したマルチカラーFISHの結果を示す。(a)はMROS3Aをプローブに、(b)はMROS3Bをプローブに用いた雄の染色体に対するFISH像を示す。

図8 Laser Sweeperを用いたY染色体のマイクロダイセクションレーザー透過フィルム上に作製したギムザ染色標本をLaser Sweeperで自動マイクロダイセクションを行った様子を示している。中期染色体がある位置をコンピューターに記憶させ(a)、その周りの領域を自動的にレーザービームで昇華する(b)。さらに、高倍率で観察し、Y染色体以外のX染色体や常染色体をレーザービームで昇華する(c)。残ったY染色体だけを回収する(d)。

図9 Y染色体DNAを用いた雄の染色体に対するFISH像ピオチン標識Y染色体DNAプローブをアピジン-FITCで検出したFISH像を示す。プローブの200倍の雌ゲノムDNAをcompetitorとして用いた。染色体はプロピディウムイオダイド染色した。全染色体にシグナルが観察された。

図10 Laser pressure catapulting (LPC法)による花粉一個の雌雄判定花粉10個をLPC法で回収し、各々の花粉をDOP-PCRで増幅したPCR産物をMROS2のSTSプライマー(上段)とPYS1のSTSプライマー(下段)でさらに増幅した。なお、MROS2-STSはnested PCRにより検出した。マーカーはX/HincIIを示す。10個の花粉すべてにMROS2-STS(182bp)は検出されたが、PYS1-STS(186bp)は4個の花粉にのみ検出された。

図11 PYS1のFISH像DIG標識したPYS1をHNPP/Fast Red増幅法で検出した。染色体はDAP1染色した。通常の検出条件(a)では、染色体全面にシグナルが観察されるが、厳しい検出条件(b)ではX染色体の長腕中央部とY染色体の両腕中央部に強いシグナルが観察された。