水の微生物学的安全性を確保するための最重要課題として、水系感染性の腸管系ウイルスが挙げられる。これらのウイルスを培養するのは容易ではなく、特別な施設と熟練した技術を必要とする。ウイルスを培養することなくウイルスを検出する方法としてはPCR(ポリメラーゼチェインリアクション)法が最も有望である。しかしながら、PCR法を水環境中の病原ウイルスの測定に適用するための知見は十分に得られていないのが現状である。特に、不活化ウイルスを誤陽性と判定することに関する知見と、ウイルスを濃縮する技術が必要とされている。

　本研究では、RT-PCR法を用いてUV照射により不活化されたウイルスを測定した場合に生じる誤陽性のメカニズムの解明と、RT-PCR法を用いて検出することを前提としたウイルス濃縮法の開発を試みた。実験の対象ウイルスとしては、腸管系ウイルスのモデルウイルスとして大腸菌RNAファージQを用いた。そこで得られた知見を以下にまとめた。

　RT-PCR法によってQを定量的に測定する3つの手法を確立した。

　第一の定量方法は、最も検出感度の高いRT-PCR法の検出結果にMPN法を適用する方法(normal RT-PCR定量法)である。normal RT-PCR定量法は、培養法のプラック数(PFU値)の約1/3の値を再現性よく与える定量方法であることがわかった。

　第二の手法は、TaqMan ProbeによるPCR産物の定量法(TaqMan RT-PCR定量法)である。プライマーの設計および酵素の選定、PCRサイクル数などの最適化を行ない、定量性を確認した。

　第三の手法として、PCRの増幅領域は通常の長さで、逆転写領域を長くしたRT-PCR法(long RT-short PCR法、MPN値を算出する場合にはlong RT-short PCR定量法)を開発した。非特異的なプライマーを適用した結果と比較し、逆転写反応はプライマーに特異的な部位から反応を開始していることを確かめた。このlong RT-short PCR法で増幅が観察されれば、PCRの増幅領域のみならず、逆転写反応の開始点とPCR増幅領域に挟まれた領域のRNAもcDNAに転写されていたことが分かる。

UV照射によるQの不活化(第4章)

　RNAウイルスをUV照射した場合に生じるRT-PCR法の誤陽性のメカニズムを調べた。

　QをUV照射により不活化し、プラック法、normal RT-PCR定量法、long RT-short PCR定量法の三つの測定手法を用いてQ生残数を測定した。Q生残数は、プラック法では一次反応的に減少したのに対し、normal RT-PCR法およびlong RT-short PCR法ではほとんど減少しなかった。

　long RT-short PCR法のこの結果は、Qの逆転写領域以外のRNAに損傷が起きているから誤陽性が生じるというメカニズムでは説明がつかず、増幅領域内のRNAに損傷があってもRT-PCR法でQを陽性と判定していることを示している。UV照射によりウラシルダイマー等の二量体が形成されても、逆転写反応はそこで停止せずにcDNAを合成し続けることが明らかとなった。

　Qを用いて得られたこの結論は、RNAウイルスに普遍的な反応機構を用いているので、他のRNAウイルスにも適用可能であると考えられる。よって、RNAウイルスをRT-PCR法により測定する場合には、UV照射によって不活化されたウイルスを陽性として判定することになるといえる。UV照射消毒された水のウイルス的安全性を測定する際には、RT-PCR法はウイルス感染の危険性を過大評価する手法であるといえる。

　ウイルスの曝露に対する健康リスクを考慮すると、100L程度の大量の水から1個の病原ウイルスを検出する手法が望まれている。既存の濃縮手法は、RT-PCR法による検出に適していない等の様々な問題点があり、まだ標準的なウイルス濃縮手法はない。ここではRT-PCR法による検出を前提としたウイルス濃縮法の開発を試みた。

　陽電荷膜と陰電荷膜の吸着材としての性能を総合的に比較した結果、無機の誘出液を用いることのできる陰電荷膜を吸着材として選択した。

　陰電荷膜からの誘出を容易にするための手段として、洗浄工程を考案した。洗浄液としてpH5程度の希硫酸溶液を選び、Q吸着後の陰電荷膜の酸洗浄を試みた。酸洗浄工程では、(1)Qを誘出しないこと、(2)マグネシウムイオンを誘出すること、(3)Qを不活化しないこと、(4)ビーフエキス溶液による誘出が容易になること、を確認した。陰電荷膜を用いたウイルス濃縮においては、酸洗浄は非常に優れた効果があるといえる。

　ウイルスゲノムRNAの誘出を目的として、セルロース吸着・フェノール誘出法を試みた。疎水性のセルロースをフェノール層に、親水性のRNAを水層に分離することによって誘出を行った。水層に誘出したQRNAの回収率は低く(0.38%)、RNAとセルロースの吸着作用が強いことが明らかとなった。

　陰電荷膜法の誘出工程に、ウイルスの活性を無視した高いpHのNaOH溶液を用いるウイルス濃縮法を試みた。誘出液のpH、誘出液量、洗浄液量および誘出速度を最適化した結果、45%(標準偏差19%)という高いQRNA回収率を得た。この新しいウイルス濃縮法は、再濃縮が容易であると見込まれるので、PCR法でウイルスを検出することを前提とする場合には、優れたウイルス濃縮手法である。また、ウイルスの外套タンパクの性質に影響を受けにくいウイルス濃縮手法であることも、この濃縮法の大きな利点である。

　水中ウイルス測定方法として、ウイルス濃縮からウイルス検出法までを総合的に考慮して評価すれば、陰電荷膜吸着・酸洗浄・アルカリ誘出法は最も有力なウイルス濃縮法であるといえる。