単位葉面積当たり光合成速度(LPS)を向上させることは、作物の生産性を上げるための一つの要素として重要である。C3植物の炭酸固定酵素であるリプロースー1.5-ビスフォスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RubisCO)の基質となる無機炭素は、大気中から気孔、葉肉細胞間隙を通り、葉緑体内ストロマの炭酸固定部位にまで輸送される。こうした無機炭素の輸送は、濃度勾配に従った受動的拡散によって行われる。したがって、無機炭素の葉肉細胞内における移動抵抗(Rr)は、RubisCOの炭酸固定能と並んで、LPSを律速する要因となっている。

　ところで、細胞内の溶媒は水であるため、無機炭素は細胞内において,CO₂、HCO₃^-、CO₃^2-のいずれかの形で存在している。飽和光下の葉肉細胞細胞質に存在する無機炭素は、そのほとんどがHCO₃^-で存在している。しかし、細胞膜・葉緑体包膜のような膜系を通過できるのはCO₂のみである。今回導入を試みたカーボニックアンヒドラーゼ(E.C.4.2.1.1以下CA)は、CO₂とHCO₃^-の変換反応を触媒する酵素であるが、C3植物の葉肉細胞細胞質にはほとんど存在しないと言われている。もし、このCAを何らかの方法によって葉肉細胞細胞質に特異的に発現させることができれば、無機炭素の生体膜透過性を容易にし、その細胞質内移動速度が促進される可能性がある。本研究は、マウスのCA活性を遺伝子導入技術によりタバコの葉肉細胞細胞質に特異的に発現させ、無機炭素の細胞質内移動速度を促進させることによって、LPS、および、生長速度が促進されるかどうかを調べたものである。得られた結果の概要は次の通りである。

　1.アグロバクテリウムのリーフディスク法により、マウスCAII型のcDNAを含む遺伝子カセットを、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターを有するベクターpBfCA010を介してタバコ葉へ導入した。得られたカナマイシン耐性株の解析により、導入遺伝子カセットが安定して後代に遺伝されていることが確認された。また、動物CAに特異的に結合する抗体を用いたウエスタン解析により、マウスCAタンパクがこれらの植物葉内に発現していることが確認された。さらに、自殖第1代種子を用いたカナマイシン耐性試験によって、これらの植物には、遺伝子カセットが1または2コピー導入されていることが推測された。

　2.導入遺伝子により発現する外来CA活性を、植物葉内の内生CA活性と区別して測定する方法を検討した。そして、葉抽出液の酸化処理、およびacetazolamideによる動物由来CAの特異的阻害効果を利用することにより、外来CAと内生CAの活性を分別測定する方法を確立した。この方法を利用して、得られた形質転換体(Foreign CA植物、以下fCA植物とする)の葉内での外来CA活性を測定したところ、発現している外来CA活性は、最高で全CA活性の約1%であった。

　3.また、外来CAタンパクの局在性について調べるために、葉肉細胞を葉緑体とその他のフラクションに分けてCAタンパク量を解析した。その結果、外来CAは、内生CAの大部分が局在する葉緑体フラクションからは検出できなかった。このことに加え、用いた遺伝子カセットに、発現タンパクを他のオルガネラに運ぶようなトランジットペプチドがコードされていなかったことを考慮すると、外来CAは、fCA植物葉肉細胞の細胞質に局在していると推定された。

　4.播種後7週目におけるfCA植物の葉と野生株の葉とで、クロロフィル、およびRubisCO含量を比較したところ、それらについては、両者の間に差が認められなかった。さらに、飽和光条件下におけるLPSは、外来CAの発現レベルが高い個体群(High CA個体)においてさえ、通常のCO₂濃度条件下では、野生株より高い値を示さなかった。しかし、CO₂濃度がLPSの強い律速要因となっている低CO₂濃度条件においては、High CA個体のLPSは、野生株より有意に高い値を示していた。

　5.葉内の外来CAの発現量を増加させる目的で、より高い遺伝子発現ポテンシャルを有する改良型プロモーターを有するベクターpBffCA010を用い、別の形質転換体(ffCA植物)を作出した。播種後6週目における最上位展開葉で比較した場合、ffCA植物の中の1株(ffCA・3株)では、fCA植物のHigh CA個体より約3.2倍もの高い外来CAタンパクの発現レベルを示していた。また、播種後9週目における外来CAの活性についても、ffCA・3株は、High CA株より、約1.63倍の高い活性を示していた。

　6.播種後8および9週目におけるffCA・3株の強光下LPSを野性株と比較したところ、低CO₂条件のみならず、fCA植物では促進効果が見られなかった通常の大気条件においても、LPSの促進が見られた。しかしながら、低CO₂濃度条件において観察されたLPSの促進率は、fCA植物においてみられた率とほぼ同じであった。したがって、CA活性の発現レベルをffCA植物以上に増加させても、観察された率以上の促進効果は期待できないと考えられた。

　7.前記6のLPSの測定は、強光下(1000E/m²s)で行われたものである。これに対し、LPSの測定を弱光下(500E/m²s)で行った場合には、ffCA・3株と野性株との間で有意な差は認められなかった。この理由として次のようなことが考えられた。すなわち、強光下でのLPSの律速要因はCO₂濃度であるのに対し、弱光下でのLPSの律速要因は光強度である。したがって、無機炭素の葉肉細胞内拡散速度を促進する外来CAを導入したffCA・3株のLPSは、強光下では促進されても、弱光下では促進されなかったと考えられた。

　8.LPSの測定とクロロフィル蛍光解析とを併用して、無機炭素の葉肉細胞内移動抵抗(Rr)を算出した。その結果、ffCA・3株では、Rrが、野生株に比べ有意に低下していることが明らかになった。この時、気孔抵抗(Rs)、葉肉細胞内固定抵抗(Rx)については、両植物間で有意な差が見られなかった。このことから、外来CAは、葉肉細胞内での無機炭素の移動を特異的に促進していると考えられた。

　9.生育途中の植物体について非破壊的葉面積測定を行い、葉面積の同じ植物体のみを選別して自然光下において17日間栽培し、その生長速度を調べた。その結果、ffCA・3株では、葉面積、草丈、乾物重のいずれにおいても、野生株よりその値が大きく勝っていた。これにより、CA活性の導入は、LPSと同時に生長速度をも促進することが明らかとなった。このとき、野性株に対するffCA・3株の生長促進率は、LPSにおける促進率よりも、はるかに大きなものであった。これは、LPSの増加に加え、葉面積の拡大による個体レベルでの受光量の増加が貢献しているものと考えられた。すなわち、ffCA・3株では、生長の初期からLPSが促進されており、その光合成産物が葉面積の拡大に回されたため、LPSの促進と葉面積の拡大が、相加的に生長の促進に貢献したものと考えられた。このことから、LPSの小さな促進も、生長には大きな貢献をすると考えられた。

　10.これに対し、50%の遮光条件下で生育させた場合には、生長速度の促進は見られず、むしろffCA・3株の生長が悪くなった。これは、ffCA-3株におけるLPSが、弱光条件下では促進されなかった7の結果に由来すると考えられた。しかし、その生長が阻害される機作については明らかにすることはできなかった。

　遺伝子導入を初めとする、いわゆるバイオテクノロジーの諸技術は、最先端の育種技術として昨今注目を集めている。しかしながら、これらの技術を用いて、作物のポテンシャルイールドを向上させた例は現在のところ極めて少ない。これは、収量や生産性といった量的形質が、1つの遺伝子ではなく、多数の遺伝子群によって決定されているためである。こうした状況の中で、本研究は遺伝子導入技術により作物の物質生産性の改善を企図したものであり、ある一定の成果が得られたと考えている。今後こうした方向で、作物生産の向上を目指していきたい。

　C₃植物における単位葉面積当たり光合成速度(LPS)は、気孔開度、炭酸固定に関わる酵素活性と同時に、葉肉細胞の細胞間隙から炭酸固定部位までの無機炭素の拡散速度によっても制御されている。ところで、カーボニックアンヒドラーゼ(炭酸脱水素酵素、CA)は、無機炭素の生体膜を介した拡散過程を促進する働きを持つにも関わらず、C₃植物の葉肉細胞細胞質にはほとんど存在しない。本研究は、マウスのCA活性を遺伝子導入技術によりタバコの葉肉細胞細胞質に特異的に発現させ、無機炭素の細胞質内移動速度を促進させることによって、LPS、および、生長速度が促進されるかどうかを調べたものである。得られた結果の概要は次のようにまとめられる。

　1.アグロバクテリウムのリーフディスク法により、マウスCAII型のcDNAを含む遺伝子カセットを、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターを有するベクターpBfCA010を介してタバコ葉へ導入した。得られたカナマイシン耐性株の葉内に、マウスCAタンパクが発現していることを、ウェスタン解析により確認した。

　2.動物由来と植物由来のCAの酸化条件に対する反応の違い、およびacetazolamideによる動物由来CAの特異的阻害効果を利用することにより、発現した外来CA活性を、植物葉内の内生CA活性と区別して測定する方法を確立した。これを利用して測定したところ、得られた形質転換体(ForeignCA植物、以下fCA植物)の葉内で発現している外来CA活性は、最高で全CA活性の約1%であった。

　3.外来CAタンパクの局在性について調べた結果、外来CAは、葉緑体フラクションからは検出できなかった。このことより、fCA植物葉肉細胞における外来CAの局在部位は、細胞質であると推定した。

　4.播種後7週目における、fCA植物と野生株の、飽和光条件下におけるLPSを測定したところ、CO₂濃度がLPSの強い律速要因となっている低CO₂濃度条件においてのみ、外来CAの発現レベルが高いfCA個体群(HighCA個体)で、野生株より有意に高くなっていた。

　5.改良型プロモーターを有するベクターpBffCA010を用い、外来CAの発現量の高い形質転換体(ffCA植物)を作出した。播種後6週目の外来CAタンパク含量、および、播種後9週目の外来CA活性を比較したところ、それぞれ、fCA植物のHighCA個体より約3.2倍、および、1.63倍もの高い発現レベルを示していた。

　6.播種後8および9週目におけるffCA植物の飽和光下におけるLPSは、低CO₂条件のみならず、通常の大気条件においても高くなっていた。これに対し、弱光下でのLPSには、ffCA植物と野生株との間で有意な差は認められなかった。これは、CO₂濃度よりむしろ、光強度によってLPSが律速されているような条件下では、外来CAによる促進効果がないためと考えられた。

　7.LPSの測定とクロロフィル蛍光解析とを併用して、無機炭素の葉肉細胞内移動抵抗(Rr)を算出した結果、ffCA植物では、野生株に比べ有意に低下していた。

　8.播種後5週目のffCA植物の生長速度を17日間に渡って調べたところ、葉面積、草丈、乾物重のいずれにおいても、野生株に比べその値が大きくなっていた。このとき、野生株に対するffCA植物の生長促進率は、LPSにおける促進率よりも、はるかに大きなものであった。これは、ffCA植物では、生長の初期からLPSが促進されており、その光合成産物が葉面積の拡大に回されたため、LPSの促進と葉面積の拡大が、相加的に生長の促進に貢献したことによるものと考えられた。

　9.これに対し、50%の遮光条件下で生育させた場合には、生長速度の促進は見られず、むしろffCA植物の生長が悪くなった。これは、ffCA植物におけるLPSが、弱光条件下では促進されないことに由来すると考えられた。

　以上、本論文は、遺伝子導入によりタバコ葉肉細胞細胞質にカーボニックアンヒドラーゼを特異的に発現させ、光合成能力、生長速度に及ぼす影響を調べたものであり、学術上、応用上貢献するところが大きい。よって審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。