はじめに、味物質を受容する分子の解明に当たり、視覚・嗅覚のレセプターがG蛋白質共役7回膜貫通型であることを念頭に置いて研究に着手した。すなわち、味覚のシグナル伝達の過程で甘味は細胞内のcAMPの濃度を上昇させ、苦味は細胞内のIP₃の濃度を上昇させることが生理学的・生化学的研究によって明らかにされていることから、味覚も視覚・嗅覚と同様のG蛋白質共役型レセプターを介した系であろうという仮説の基に研究を行った。まず、嗅覚レセプターの構造を参考にし、その中で特に相同性の高い2番目と7番目の膜貫通部位のアミノ酸配列に相当する塩基配列を基にしたプライマーと、ラット舌上皮由来のmRNAから作製したcDNAの鋳型を用いてPCRを行い、G蛋白質共役型レセプターの断片を60種以上得た。これらをアミノ酸配列の相同性に基いて分類すると6つのグループとなった。また、ゲノムサザン分析より、別々の遺伝子に由来することが示唆された。

　次に、RT-PCRクローンをプローブとして舌上皮のcDNAライブラリーのスクリーニングを行い、7回膜貫通ドメインを持つG蛋白質共役型レセプターであるGUST27を得た。GUST27は60のRT-PCRクローンの1つPTE33と最もよく似ており、相同性は80%であった。また、嗅覚レセプターであるOLFF3との相同性は56%と高かったが、視覚レセプターであるロドプシンとの相同性は16%であった。

　GUST27の組織特異的発現を調べるために様々な組織由来のmRNAを用いてノーザンブロット解析を行ったところ、舌上皮にのみハイブリダイズする約2kbのバンドが見られた。in situハイブリダイゼーションを行ってGUST27mRNAの発現部位を調べたところ、味蕾を含む舌上皮に発現することが明らかになった。また、GUST27特異的な抗体を作製して染色を行ったところ、主に味蕾の部分に発色がみられた。以上よりGUST27は味蕾を中心とした場所に発現する味覚レセプターである可能性が強く示唆された。

味蕾に発現するGタンパク質サブユニットの種類とその発現部位

　味覚シグナリング機構を解明する上で、味蕾に発現する味覚レセプターと共役するGタンパク質を明らかにすることは重要である。一般に、Gタンパク質の種類によってエフェクターおよびセカンドメッセンジャーを推定し、その生理作用を予想することが可能となる。味蕾はI〜IV型の細胞種で構成される40〜70個の細胞集団であり、このうちIII型が味を受容する味細胞とされているが、I、II、III型は全て紡錘形であり、形態上の区別が光学顕微鏡レベルではできない。また、マーカーとなりうる分子も全く特定されていない。そこで、Gタンパク質の主な性質を担うサブユニット(Gタンパク質)に焦点をあて、味蕾に発現している種類、および細胞レベルでの分布を調べることにより味蕾を構成する細胞の類型化を試みた。以後、味蕾を構成するI、II、III型細胞を味蕾細胞と記載する。

　まず、味蕾に発現しているGタンパク質mRNAの種類を調べた。既知の全てのGタンパク質に共通なアミノ酸配列に相当するプライマーと、舌の有郭乳頭から得た約100個の味蕾由来cDNAを鋳型としてPCRを行った。その結果、味蕾にはGiファミリーに属するGi1、Gi2、Gi3、gustducin、Gsファミリーに属するGs、Gqファミリーに属するGq、G15のmRNAが発現していることが明らかになった。G15は今まで造血細胞に特異的であることが知られていたが、今回初めて味蕾に発現することを見出したものでもある。また、Gsはスプライシングの違いによる2種類のmRNAの存在が確認された。図のように、現在までに甘味物質が細胞内のcAMP濃度を上昇させることと、苦味物質が細胞内IP₃濃度の上昇、あるいはホスホジエステラーゼ(PDE)の活性化を誘導することが明らかになっていることから、味覚にはGi、Gs、Gqファミリーの関与が示唆されており、今回の結果と一致した。

　続いて、これらのGタンパク質mRNAの発現を調べるためにin situハイブリダイゼーションを行った。その結果、gustducinの発現する細胞は全ての味蕾に認められたが、1つの味蕾内には数個に限られることが明らかになり、gustducinの有無を指標にした味蕾細胞の分類が可能になった。一方、Gs、Gi2はどの味蕾にも、gustducinと比較して明らかに多くの細胞に発現していた。そこで発現パターンの異なるgustducinとGsを対象としたsingle-cell RT-PCRより、各々のmRNAを発現している細胞の割合を調べた。Single-cellは舌上皮をコラゲナーゼ処理後、遊離した細胞のうち紡錘形のものを単離することにより選択した。その結果、細胞106個の内、35個にgustducinが、44個にGsが、20個に両者の発現が認められた。Gsとgustducinは味覚のシグナル伝達に関与するセカンドメッセンジャーであるcAMP量を正反対に調整する役割を持つ。従って、セカンドメッセンジャーの1つに限定して考えても、それを増加、減少、増減といった応答の異なる細胞が味蕾に存在することを示し、味覚の複雑さを表している。

図表

　次に、味蕾由来のGタンパク質の細胞内での局在を、抗体を用いて染色した。その結果、Gタンパク質の発現は2パターンを示した。すなわち、Gi1、Gi2、Gi3、Gsは味孔に局在し、gustducin、Gq、G15は細胞内全体に存在した。味孔は味物質と生体との接点であることから、味孔に存在が認められる複数種のGタンパク質は、そこに発現している可能性のある味覚レセプターと共役しうると考えられる。しかも、これらのGタンパク質及びレセプターが多種であることは、シグナル伝達のスキームに多様な組み合わせがあることを示唆する。実際に、gustducinが蔗糖やデナトニウムの苦味のシグナリングに関与することが、ノックアウトマウスを用いた実験により既に報告されている。しかし、gustducinノックアウトマウスはサッカリンの甘味の感受性を有し、苦味に対する感受性を大部分残していることも明らかになっている。よってgustducinを介さない甘味と苦味に対しては他のGタンパク質が関与すると思われる。特に、G15はGiファミリーやGsファミリーに結合するレセプターにも共役するユニークな性質を持っていることが報告されており、G15は味蕾に存在している様々なGタンパク質共役型レセプターと結合して細胞内のIP₃濃度を上昇させる可能性が示唆された。

　味を受容した味細胞はシナプスで神経伝達物質を放出して味神経にシグナルを伝達する。神経伝達物質の放出にはシナプス部位のカルシウムイオン濃度の上昇が必要であるとされ、電位依存性カルシウムチャンネルを介して細胞外からカルシウムイオンを取り込んだ結果引き起こされることが多い。味蕾には様々な組織に発現するL、T型のカルシウムチャンネルが存在することが生理学的に示唆されているが、分子生物学的には明かではなかった。そこで味蕾に発現しているカルシウムチャンネルの種類およびその発現部位を解析することにした。

　まず、ラット有郭・葉状乳頭上皮由来のmRNAを用いてRT-PCRを行ったところ、予想されたL型のみならず、今までその存在が示唆されていない神経特異的なP(Q)型、N型も存在することが明らかとなった。

　次に、それぞれの抗体を用いて抗体染色を行い有郭乳頭における発現部位を調べた。その結果、L、N、P(Q)型全てのカルシウムチャンネルが味孔に局在していることが示された。味孔でのカルシウムイオンの働きを示唆する知見は皆無であるが、味受容あるいはシグナル伝達に何らかの関わりを持つ可能性がある。また、神経性のN、P(Q)型は味蕾中の数個の細胞の基底部側に局所的な発現が見られた。一般に、N、P(Q)型は神経のシナプス前膜に存在し、シグナル伝達物質の放出に関与することが知られており、味蕾細胞の基底部側に存在するシナプス部位もシナプス前膜に相当することから、味蕾に存在するN、P(Q)型は味蕾細胞から味神経へのシグナル伝達物質の放出にも関与していると考えられた。この成果はシグナル伝達物質そのものを特定する研究に貢献するはずである。

　本研究において、味蕾を含む上皮に発現するレセプターをクローニングし、それらが味覚レセプターであることを強く示唆する結果を得た。続いて味蕾に存在するGタンパク質及びカルシウムチャンネルの種類、発現パターンを解析した。その結果、gustducinとカルシウムチャンネル、N、P(Q)型がそれぞれ限られた細胞に発現していることが初めて明らかになった。味蕾細胞は形態学的解析によって4種類に分類されてきたが、今後、gustducinとカルシウムチャンネルの発現を免疫電顕で明らかにすることにより、味蕾細胞の分類ならびに役割を分子レベルで定義しうる可能性を示した。また、本研究では細胞レベルでのRT-PCRを確立した。この成果は、1つの味物質に対して特徴的な電気シグナルを発生する味蕾細胞に特異的な分子の解明に繋がるのみならず、細胞の分子生物学的研究一般に普く貢献すると考えられる。

　1.Abe,K.,Kusakabe,Y.,Tanemura,K.,Emori,Y.and Arai,S.(1993)FEBS Lett.,316,253-256.

　2.Abe,K.,Kusakabe,Y.,Tanemura,K.,Emori,Y.and Arai,S.(1993)J.Biol.Chem.,268,12033-12039.

　3.Kusakabe,Y.,Abe,K.Tanemura,K.,Emori,Y.and Arai,S.(1996)Chem.Senses,21,335-340.

　4.Kusakabe,Y.,Arai,S.and Abe,K.(1997)Chem.Senses,22,228.