高等植物の伸長生長の制御には,ジベレリン(GA)やオーキシン(IAA)等の植物ホルモンが深く関与している.これまでに,植物ホルモンによる伸長生長の制御については,生理学的,分析化学的あるいは形態学的な研究が行われてきた.しかしながら,植物ホルモンによる刺激とそれに対する応答の間にどのような反応が介在しているかについては,ほとんど明らかにされていない.

　ところで,微生物から高等生物にいたるまで,それぞれの細胞は種々の刺激に対し特異的な応答を示す.動物や酵母では,このような生理的変化に関与しているタンパク質の多くが,その活性をリン酸化により調節されていることが明らかにされつつある.従って,生理的変化を引き起こす刺激が,何らかの方法によりタンパク質リン酸化酵素(PK)に伝えられ,さらにその情報が伝達された結果,最終的な生理的変化を引き起こすと考えられる.植物の様々な生理現象の制御に関与する植物ホルモンのシグナル伝達においても,タンパク質のリン酸化が重要な役割を担っていると考えられるが,その研究は未だ不十分である.

　キュウリ(Cucumis sativus L.)幼植物体は,ジベレリンA₄(GA₄)やIAAを茎頂に投与することにより顕著な伸長生長が観察され,無傷の状態でホルモン応答を示すことから,植物ホルモンによる伸長生長の制御機構解明のための良い実験材料である.本研究では,キュウリ胚軸を植物材料として,伸長生長制御に関与するPK遺伝子のクローニングを試みると共に,その遺伝子の生体内における機能を追究することを目的とした.

　植物の生長・生理は、植物ホルモンを始めとする生長調節物質によって精妙に調節されている。従来、オーキシンやジベレリンなどの植物ホルモンの生理作用については数多くの研究がなされてきたが、それら植物ホルモンの作用機構、とくにシグナル伝達系についてはほとんど解明されていない。他方、真核生物におけるシグナル伝達系において、タンパク質のリン酸化が重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。本論文は、このような背景のもとに、オーキシンならびにジベレリンによって引き起こされる茎部伸長と、それら植物ホルモンに応答性を示すタンパク質リン酸化酵素(protein kinase以下PKと略記)遺伝子との関係を追究した結果をまとめたもので4つの章からなっている。

　第1章で本研究の背景ならびに意義を述べた上で、第2章ではキュウリ芽生えにおいてオーキシンあるいはジベレリンに応答性を示すPK遺伝子のクローニングについて述べている。キュウリ芽生えはジベレリンならびにオーキシンに鋭敏に反応して茎が伸長するが、そのさいに発現するPKを遺伝子の面から追究するため、以下の実験を行った。すなわち、セリン/トレオニンPKの触媒ドメインの内のサブドメインVIBとVIIIの保存配列に対し縮重プライマーを作製し、これを用いてキュウリ胚軸より調製したcDNAを鋳型としてPCRを行い、キュウリ胚軸でmRNAが発現している8種類のセリン/トレオニンPKのcDNAの部分断片をクローニングした。それらのうち一つであるであるジベレリン応答性PK遺伝子CsPK3は、オーキシンに対しても早い時期に、かつ鋭敏に反応するという特性を示した。他方、構造解析により、CsPK3は、PKの触媒ドメインのサブドメインVIIとVIIIの間に挿入配列を持つ植物に特異的なPK遺伝子に相同性を有することが明かとなった。CsPK3のゲノムDNAの塩基配列を決定した結果、CsPK3のコード領域より上流の配列に、ダイズのオーキシン応答性遺伝子のプロモーター配列に存在するオーキシン応答配列(AuxRE)のコア配列と共通の配列が存在することが示された。しかし、CsPK3におけるこの領域がAuxREとして機能しているかどうかを明らかにするには更なる実験が必要である。

　第3章においては、CsPK3の発現解析について述べている。まずキュウリ胚軸におけるCsPK3mRNAの発現をノーザンブロッテイング法により調べた結果、ジベレリンならびにオーキシン、特にオーキシンに対し顕著な応答性を示し、オーキシン誘導性の伸長生長と高い相関関係を示した。さらに、植物組織内におけるCsPK3の遺伝子発現をin situハイブリダイゼーション法、ならびにCsPK3プロモーター・レポーター融合遺伝子を導入した形質転換タバコを用いて解析した結果、植物体内におけるオーキシンの生合成および生理作用と関連のある部分でCsPK3の発現が認められることが明かとなった。また、タンパク質合成阻害剤を用いる実験により、CsPK3の遺伝子発現は新しく合成されるタれるタンパク質を介していない可能性が示されたことから、オーキシンの受容から生理作用発現に至る経路上においてCsPK3が機能していることが示唆された。

　第4章においては、CsPK3の機能解析を行うために形質転換体を用いて追究した結果について述べている。遺伝子の機能解析には、当該遺伝子を過剰発現する形質転換体を作出する方法がある。まずキュウリを対象として形質転換体の作出を試みたが、遺伝子導入後の再生個体を得るには至らなかった。そこで、CsPK3のタバコ相同遺伝子を2種類クローニングし、センスまたはアンチセンス方向に過剰発現させるような融合遺伝子を作製し、これを導入した形質転換タバコを作出し、遺伝子発現ならびに表現型の変化を観察した。その結果、早期に花芽分化が起こるなど興味ある個体の出現が認められたが、CsPK3の生体内における機能につながるような表現型を得るには至っていない。

　本研究において、植物ホルモンであるジベレリンとオーキシンに応答性を示し、同時にこれらのホルモン作用と密接な関係を有すると考えられるタンパク質リン酸化酵素遺伝子CsPK3の特定と性状解析がなされた。この結果は、植物ホルモンによる生理作用発現機構、とくにシグナル伝達機構解明の一つの端緒となり得るものと考えられる。

　以上、要するに、本論文に示された結果は、植物生理・生化学、植物分子生物学において重要な結果を提示したものであり、学術上寄与するところが少なくない。よって、審査委員は本論文が博士(農学)の学位論文となり得る価値を有するものと結論した。