植物ホルモンの一種であるジベレリン(GAs)は、発芽、茎葉の伸長、性の分化など様々な生理現象の発現制御に関わっていることが知られている。このようなGAsに特有な生理現象のうち、穀類種子の種子発芽に関しては、GAsの生理的役割やシグナル伝達機構に関する研究が精力的に展開されている。

　一方、双子葉植物においては、ヒルガオ科(Convolvulaceae)やマメ科(Leguminosae)の植物の未熟種子に多様なGAsが高い濃度で存在することが報告され、これらの種子の成熟過程においてもGAsが重要な役割を果たしている可能性が推論されてきたが、具体的な機能については、未だ何も明らかにされていない。

　本研究では、ヒルガオ科のアサガオ(Pharbitis nil Choisy cv.Violet)の種子を材料として、その成熟過程におけるGAsの量的変動を追究するとともに、特異抗体を用いて免疫組織化学的手法によりその局在部位を明らかにすること、さらにその結果に基づき、双子葉植物の種子の成熟におけるGAsの役割を解明するための基盤を構築することを目的とした。

　本学付属多摩農場で栽培したアサガオの開花直後の花の花柄にタグをつけ、それぞれ開花日より異なる日数を経た種子を採取し、抗GA₁-メチルエステル(GA₁-Me)抗体を用いるエンザイムイムノアッセイ(ELISA)により免疫反応性物質の検出を行った。HPLC分析の結果、いずれの成熟段階の種子においても活性型GAsであるGA₁及びGA₃の保持時間に一致する溶出画分に免疫反応が認められたが、この抗体に交差反応性を有するGA₄やGA₇及び結合型GAsの存在を示す画分は認められなかった。したがって、本論文で述べる定量分析値および免疫染色はすべてGA₁とGA₃(の双方、あるいは一方;以後GA₁/GA₃と表記)に起因すると判断してよいことが確認された。

　GA₁/GA₃の内生量の経時的変化をELISAにより追究したところ、開花より12日を経過した時点で急激に増加することが判明した。この時期は種子の生重量が急激に増加する時期と一致し、同化産物の転流との関係が注目される。また、この時期のGA₁/GA₃の急激な変化の原因がGA₁、GA₃の双方あるいはいずれか一方の変化に起因するものかどうかを明らかにするために、陰イオン交換ゲルを用いたHPLCによりGA₁とGA₃を分離・定量した。その結果、上述の開花後12日目前後の変化に関しては、GA₃の内生量が9日〜15日の間においても200pmol/g fw前後を維持していたのに対し、GA₁の内生量は9日目、12日目、15日目にそれぞれ14.0pmol/g fw(58.3pmol GA₃相当/g fw)、61.0pmol/g fw(254.2pmol GA₃相当/g fw)、23.0pmol/g fw(95.8pmol GA₃相当/g fw)と約4倍の変動を示した。このことから、この時期の免疫反応の急激な変化は、GA₁に起因することが明らかとなった。

　3種類のアフィニティーカラムにより、免疫組織化学に用いる抗体を精製した。この精製により、GA₁/GA₃の特異的検出の妨げとなる抗体の非特異的な結合の大幅な軽減に成功した。植物組織へのGAsの固定には、凍結乾燥-蒸気固定法を用いた。未熟種子を採取し、直ちに液体窒素で凍結し、-20℃で凍結乾燥した。別々の容器に入れた試料とN,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)を吸引デシケーターの中に置き、減圧・気化させたDIPCによるGAsの組織への固定を行った。この一連の操作におけるGAsの移動は、少なくとも組織レベルでは無視し得ると考えられる。蒸気固定後、常法に従い組織切片を調製し、上述の精製抗体を用いて染色を行った。この際、予め過剰量のGA₁-Meと反応させておいた精製抗体を用いた染色を対照区に設定し、常に両者の比較により特異的染色部分を特定できるように企図した。GA₁/GA₃に由来する特異的染色を種子の成熟に伴う発達状況と比較しながら以下に詳述する。

　種子を半切し、光学顕微鏡で子葉や胚軸の生長ならびに種子中のデンプンの蓄積を観察し、種子の成熟過程を成熟前期(開花後0〜11日、以下開花後は省略)、成熟中期(12〜23日)、成熟後期(24日以降)に分けた。9日目には約1mm前後であった子葉は、成熟中期に大きくなり、種子内の大部分が子葉で充たされるようになった。一方、すでに、デンプン粒は成熟初期に種子の大部分を占めている珠皮(integument)において存在が認められ、9〜18日目にかけて大きくなり(長径約7m、短径約3.5m)、成熟後期に分解されて行くことが認められた。

　GAsの免疫組織染色の結果、子葉においては9日目からGA₁/GA₃による染色が検出されはじめ、子葉での特異的染色は24日目まで続けて観察されたが、30日目以降は認められなくなった。一方、珠皮および胚乳細胞(endosperm cells)においては、9日目から特異的染色が認められた。この特異的染色は、12日〜18日目ではデンプン粒の核(hilum)の対極側に局在し、24日目以降デンプン粒の分解に伴って消失して行くことが認められた。この時期の種子をアミドブラックにより染色し、組織中のタンパク質を検出したところ、種皮(testa)を含むほぼ全域で検出されたことから、GA₁/GA₃特異的染色局在がこれらのGAsの固定の担体となるタンパク質の偏在によるものではないこと、すなわち、GA₁/GA₃の局在に由来するものであることが確認された。

　ところで、上述したGAsを組織内のタンパク質に固定する方法を用いた免疫組織化学では、(1)物理的な変形や流動を生じ易い部位、(2)固定されにくい部位、(3)恒常的に非特異的結合の高い部位、等においては、目的とするGAsの検出が原理的に難しい。したがって、上述の免疫組織化学では、このような部位に存在するGA₁/GA₃を看過している可能性が残されている。このような問題の克服を目的として、ティッシュプリンティング法による検出を検討した。ティッシュプリンティング法においても蒸気固定法を用い、固定と検出の最適化を図った。この方法においては、上述の免疫組織化学において認められた子葉と珠皮における染色が改めて確認されたのに加えて、従来の免疫染色においては組織間の固定効率の差異のため期待することができなかった内生量と染色強度の相関が高いことが認められた。さらに、組織への直接の固定法による免疫組織化学では確認できなかった子葉中に存在する脂肪の貯蔵場所であるgiant cellや、成熟後期の胚軸の維管束付近においても、新たにGA₁/GA₃に特異的な染色を確認することができた。

　本研究におけるGAsの免疫組織化学において、アサガオ種子の成熟過程前期にGA₁/GA₃が珠皮のデンプン粒に局在し、この部位のGA₁/GA₃はそのデンプン粒の分解とともに消失することが明らかになった。このGA₁/GA₃の動態は、多くの穀類種子においてGA₁やGA₃が-アミラーゼを誘導することを考慮すると、アサガオの種子においても、GA₁やGA₃が-アミラーゼの誘導を通して成熟の過程でのデンプンの分解に関わっている可能性を推測させる。そこで、アサガオ未熟種子における-アミラーゼ遺伝子の発現解析を行い、GAsの動態との関係を追究することを計画した。

　まず、アサガオ未熟種子で発現している-アミラーゼ関連遺伝子のクローニングを行うために、他の植物について報告されている-アミラーゼ遺伝子の塩基配列をもとに合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、開花後11〜13日目の未熟種子から調製したcDNAを鋳型にしてPCRを行った。その結果、増幅された約0.6kbの断片を2種類得た。各々をPnAmy1,PnAmy2と命名し、その塩基配列を決定した。既知の-アミラーゼ遺伝子との相同性を比較したところ、PnAmy1はヒルガオ科のCuscuta reflexaの-アミラーゼ遺伝子と87%、ジャガイモの-アミラーゼ遺伝子と82%の相同性を示し、穀類種子の-アミラーゼ遺伝子群とは69〜48%の相同性を示した。また、発芽の際に外から与えたGAsに応答することが既に報告されているケツルアズキの-アミラーゼと76%の相同性を示した。一方、PnAmy2はPnAmy1や既知の-アミラーゼ遺伝子と50%前後の相同性を示した。そこで、PnAmy1、PnAmy2の発現をノーザン解析により調べたところ、PnAmy1のmRNAの量は活性型GAsの動態に対応する変化を示した。これに対し、PnAmy2の発現量は21日目まで徐々に増加し、24日目で若干減少した。一方、-アミラーゼの活性変動は、12日目までは認められなかったが、18日目以後から徐々に増加し、PnAmy2の発現変動に対応していた。

　本研究では、双子葉植物の種子成熟過程におけるGAsの生理的役割を解明する手がかりを得ることを目的とし、アサガオ種子の成熟過程における活性型GAsの内生量の変動と局在性の解明、およびその知見に基づくGAsの役割の追究を展開した。その結果、免疫組織化学によりGA₁/GA₃が珠皮では成熟初期から中期にデンプン粒に密着して検出され、デンプン粒の分解に伴って消失することが明らかになった。また、この時期の種子から-アミラーゼをコードしていると考えられる2種のcDNA断片をクローニングした。ノーザン解析の結果、その中の一つは珠皮のGA₁/GA₃の消長と対応した発現を示した。このことから種子の成熟初期から中期において珠皮のデンプン粒に密着して存在するGA₁/GA₃は、-アミラーゼ遺伝子の発現調節を通して種子に貯蔵されるデンプンの代謝に関わっている可能性が高いことが示唆された。

　子葉中には成熟初期から中期にGA₁/GA₃の抗体染色によるシグナルが検出されたが、ティッシュプリンティングを用いた抗体染色の結果から、珠皮に比べ低濃度であることが示された。しかし、このGAsの機能を推測できるような情報は得られなかった。成熟後期にはgiant cellや胚軸にGAs、特に活性型GAsの前駆体であるGA₂₀が明瞭に検出され、GAsを高い濃度で含むアサガオ未熟種子において、giant cellが貯蔵の役割を担っており、そこに貯蔵されたGA₂₀が発芽時には活性型GAsに変換・利用される可能性が示された。

　本研究で得た新しい知見が、GAsの様々な生理的役割の解明に向けた一助となることを期待したい。