分裂酵母の細胞周期変異株としてcdc変異株が多く取得されている。cdc変異株は温度感受性変異株であり、非許容温度においては変異蛋白質の機能の失活により細胞周期の特異的な時期で生育が停止する。cdc変異株は許容温度では生育可能であるが、その変異遺伝子産物の機能は野生株に比べ低下しており、変異蛋白質自身、あるいは周辺の制御を標的とする薬剤に対して感受性が変化していることが予想される。本研究では細胞周期の中でも特にS期及びM期の開始の制御に重点を置き、G1/S期、G2/M期のcdc変異株の生育を特異的に阻害する物質の探索をペーパーディスクアッセイにて行った。その結果、Aspergillus属と思われるカビの培養液中にcdc25,cdc13など細胞分裂の開始に必須なCdc2キナーゼの活性制御に関わる変異株の生育を野生株に比べ極めて低濃度で阻害する活性を見出した。培養液をアセトンで抽出し、酢酸エチル抽出、シリカゲルカラム、ODS薄相クロマトグラフィーを行い、活性物質として抗真菌物質として報告されていたpreussinを同定した。

　またcdc2株に対し著しい細胞伸長を引き起こすとともにcdc6,cdc7,cdc14など隔壁の形成に欠損を持つ株の生育を特異的に阻害する活性を未同定のカビの培養液中に見出した。精製の結果、この活性物質は各種癌細胞の形態を正常化する物質として本研究室のKwonらにより報告されたradicicolであった。

　分裂酵母感受性株にpreussin耐性を付与する遺伝子としてhsc1⁺を単離したが、hsc1⁺破壊株はpreussin感受性に特に変化がなかったことからHsc1によるpreussin耐性機構の詳細は不明である。そこでpreussinの一次標的分子を直接に同定するために、preussinのビオチン化誘導体をストレプトアビジンに結合させたアフィニティーカラムを用いてpreussin結合蛋白質の精製を試みた。preussinのビオチン化は20mgのpreussinから始め、ベンゼン環のニトロ化、還元によりp-位、o-位にアミノ基を導入した後、6-[(biotinoyl)amino]hexanoic acid,succinimidyl ester(biotin-SE)と縮合させることによりビオチン化preussin(p-を2.1mg,o-を1mg)を合成した(下図)。本合成品は活性の減少はみられたものの、元のpreussinと同様な生物活性を示した。現在このプローブを用いてヒト癌細胞であるHeLa細胞抽出液からpreussin結合蛋白質の精製を行っている。

　細胞周期、特に細胞分裂の制御の阻害剤の取得を目的として、分裂酵母cdc変異株特異的阻害剤の探索を行い、その結果preussin、radicicolなどの活性物質を同定した。preussinは分裂の制御因子であるcdc25変異株の生育を選択的に阻害する物質として同定したが、動物細胞に対してはG1期停止を引き起こすこと、またロイシンなどの栄養要求マーカーを持つ株も阻害することからpreussinの標的分子の機能に興味が持たれる。

　preussin感受性株に耐性を付与する遺伝子として取得したhsc1⁺はそれ自身は生育に必須ではなく、破壊株もpreussin感受性にはあまり影響しない。しかしhsc1⁺とcdc25の間に遺伝学的な相互作用が見られたこと、またその時の形質がcdc25株にpreussinを処理したものと一部類似していたことから、preussinはCdc25とHsc1の相互作用を阻害することにより活性をあらわすというモデルが考えられる。しかし現在までCdc25とHsc1あるいはHsc1とpreussinの直接の相互作用は確認できておらず、三者の関係は不明である。preussin結合蛋白質の精製を目的として合成したビオチン化preussinはもとのpreussinに比べ約1/10〜1/20に低下していたものの、活性は保持しているため今後これを用いることにより標的分子の精製と同定が可能になったと考えられる。同様のことは、ビオチン化radicicolについてもいえる。

　分裂酵母cdc変異株の内、S期及びM期の開始の制御に関わる変異株の生育を特異的に阻害する物質の探索をペーパーディスクアッセイにより行い、一カビの培養液中にcdc25,cdc13など細胞分裂の開始に必須なCdc2キナーゼの活性制御の変異株の生育を選択的に阻害する物質としてpreussinを同定した。

　preussinは最も感受性の高かったcdc25株の生育を野生株の約1/500(MIC＝10ng/ml)という低濃度で阻害したが、ここで用いたcdc25株(cdc25-3)はcdc25の変異以外にura4,leu1などの栄養要求性変異を持つことから、四分子解析により各変異を単独で、あるいは様々な組み合わせで持つ株を選択し、そのpreussin感受性を調べた。その結果ura4,leu1,cdc25のそれぞれの単独変異株は全て野生株に比べ感受性が高く、もとのcdc25株の超感受性はこれらが合わさったものであることが明らかになった。このうちleu1変異はpreussin感受性に最も影響が大きかったが、これはpreussinがロイシンの生合成ではなく細胞内への取り込みを阻害することによることが示された。

　preussinはラット線維芽細胞3Y1に対しても約10g/mlで細胞伸長とG1期での増殖の停止を引き起こした。

　preussinはその選択性から、Cdc2キナーゼ、Cdc25ホスファターゼ、Wee1キナーゼなどの活性を直接阻害する可能性が考えられた。そこで精製酵素を用いて試験管内での阻害実験を行ったところ、preussinはいずれに対しても阻害効果を示さなかった。

　cdc25-3株を宿主に分裂酵母野生株のゲノムライブラリーから、preussin特異的に耐性を付与するプラスミドを単離した。この内100倍という最も強い耐性を付与したpPSR1は親株の温度感受性も相補し、塩基配列の解析の結果耐性遺伝子は野生型cdc25⁺遺伝子自身であった。

　次に解析を行ったpPSR2は塩基配列の解析の結果、耐性遺伝子として出芽酵母の細胞質タイプのHsp70であるSSB1、SSB2のホモログとして報告されていたHsc1と同一であったため、以後この遺伝子をhsc1⁺と呼ぶことにした。

　pPSR9はアラントイン酸パーミアーゼのホモログをコードするORFを含んでおり、psr9⁺と呼ぶことにした。

　hsc1⁺は遺伝子破壊の結果生育に必須ではなかったが、野生株に比べ若干生育が遅く細胞の伸長が見られた。cdc25 hsc1ura4⁺の二重変異株では細胞極性や隔壁形成の異常などそれぞれの単独変異では見られない形質を示した。この形態はcdc25株にpreussinを処理したものと類似していること、またこれらの形質はpreussin処理により強調されたことからcdc25とhsc1⁺の間に遺伝学的な相互作用が示されるとともに、この相互作用にpreussinが干渉する可能性が考えられた。cdc25株をG2期停止からのリリース後、分裂の開始を隔壁形成率を指標に調べたところ、preussin処理あるいはhsc1破壊により隔壁形成開始が遅延したことから、変異Cdc25の活性が回復する過程にHsc1が関与し、これをpreussinが阻害するというモデルが考えられた。

　preussin結合蛋白の同定を目指しpreussinのベンゼン環にビオチンを結合した誘導体を合成した。本合成品は活性は低下していたが、元のpreussinと同様な生物活性を示した。これを用いてHeLa細胞からpreussin結合蛋白質の精製を行い、約80kD及び50kd付近にビオチン化preussinを加えたときに特異的に現れるバンドを検出した。

　以上、本論文は新しい細胞周期阻害剤を単離し、それを研究の道具として用いることによって細胞周期制御に新しい知見を加えるものである。これらの結果は、学術上貢献するところが少なくない。よって審査員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値のあるものと認めた。