GTP加水分解反応はGTPaseスーパーファミリーに属するタンパク質の機能において中心的役割を担っている.ras p21,EF-Tu,サブユニット等によるGTP加水分解反応ではOH^-イオンがリン原子に対して-O結合にin-lineに攻撃した結果,-リン酸のコンフィギュレーションの反転が引き起こされる.触媒に関与する水分子はras p21,EF-Tu,などの結晶構造において,G02原子から3.4-3.8Å離れた位置に観測されている.いずれの結晶構造においても水分子とアミノ酸残基の側鎖との間に強い相互作用は存在しない.水分子よりプロトンを引き抜く塩基として働いているのは基質そのもの,つまり,GTPの-リン酸であることが示されている(substrate-assisted catalysis).本研究ではGTP結合タンパク質におけるこのsubstrate-assisted catalysisの反応機構に基づき,半経験的分子軌道法(PM3法)を用いて得たGTP加水分解反応の反応プロファイルからmutationによるGTPase活性の変化を予測した.反応プロファイルの計算に使用したGTP加水分解反応の分子モデルは,1アミノ酸残基,2リン酸,1水分子からなる.アミノ酸残基に隣接する両端の残基は水素で置換し,エネルギー最小化を行った.substrate-assisted catalysisに基づいて,GTP加水分解反応を以下の3つの素反応に分離した:(a)水分子からプロトンが脱離してOH^-を生成する反応(反応座標:H-Oの結合長),(b)OH^-がリン原子をin-lineに求核攻撃する反応(反応座標:P-Oの結合長),(c)リン酸が脱離する反応(反応座標:O-Pの結合長).反応座標の変化に伴う生成熱(H_f)の変化から反応プロファイルを得た.分子モデルのアミノ酸残基の構造はras p21のwild-typeとmutant,そしてサブユニットの構造をそれぞれ用いた.各残基についてwild-typeとmutantの分子モデルの反応プロファイルから各々のを求め,その差からを得た(図1).実験より得られているmutantとwild-typeのk_catの比(k_cat[mutant]/k_cat[wild-type])をk_rel[experiment]とし,計算されたから遷移状態理論により得られるk_cat[calculation]＝exp(-/RT)と比較したところ,定性的には正しい予測結果を得た.本研究により,ras,EF-Tu,サブユニット等でアミノ酸置換によるGTP加水分解反応の速度を予測することが可能になった.図2で,横軸はk_rel[experiment],縦軸はk_rel[calculation]を表し,実線に近いほど予測精度が高いといえる.k_rel[calculation]＝1かつk_rel[experiment]＝1の点の近傍では活性の変化は微小であることを示し,原点では活性がなくなることを示している.○と●は,各々ras p21でwild-typeとmutantの結晶構造がともに既知の場合と,mutantの結晶構造が未知の場合を表している.□はサブユニットの場合では,mutantの結晶構造が未知の場合を表している.G12V,G12P,D38Eについては,結晶解析によりwild-typeとmutantの構造が既知である.G12PとD38Eでの誤差は各々-4.5%,+3.0%であり,定量的に正しく予測されている.G12Vでは予測値が実験値の4.3倍であって精度は低いが,GTPase活性が減少するという点で,定性的には正しいといえる.G12Vのように,計算に含めていない他の残基の構造を側鎖が変化させている場合に,予測精度が下がると考えられる.Q61Eでも,予測値が実験値の4.5倍ではあるが,他の変異と異なり,GTPase活性が10¹のオーダーで増加するという特徴が一致している.このことは,ras p21のGln61が一般塩基として働いているのではなくsubstrate-assisted catalysisによりGTP加水分解反応が触媒されていることに矛盾しない.K16Hecでも,予測値が実験値の4.2倍ではあるが,GTPase活性が10^-3のオーダーで減少する,つまりほとんど活性が消失するという特徴が一致している.これはGTPase活性を持つタンパク質でLys16に相当する残基が1次配列上保存されていることと一致する.ras p21の他の残基やサブユニットの場合も定性的予測に成功している(図2).さらに,この方法をIle36置換体(非天然アミノ酸を含む)に適用した(表1).これらの結果より,Ile36の位置においては-OH基等を持つ極性アミノ酸側鎖に置換する場合にはGTPase活性が上昇し,-COOH基等を持つ負の荷電アミノ酸側鎖に置換するとGTPase活性が低下する傾向が予測された.本研究により,ras,EF-Tuやサブユニット等でアミノ酸置換によるGTP加水分解反応の速度を予測することが可能になった.

図1:反応プロファイル(Gln61 & Glu61)

図2:k_relによるGTPase活性変化の予測値と実験値の比較

表1:Prediction of k_rel[cal] in Ile36 mutants of ras p21

　1980年代初めに,Cechらによって触媒活性をもつRNA(リボザイム)が発見されて以来,多くの種類のリボザイムが見出されている.これらのなかで,ハンマーヘッド型リボザイムは,最も小さい活性ドメインをもつリボザイムのうちの一つである.ハンマーヘッド型リボザイムの活性は,RNAウィルスに含まれる低分子RNAなどに発見され,マグネシウムイオンの存在下で自己のRNA鎖を切断する.リボザイムのRNA切断機構は,切断箇所のヌクレオシド残基の2’位酸素原子が3’位にあるリン酸ジエステルのリン酸基を攻撃し,隣のヌクレオシド残基の5’残基が脱離し,RNA鎖の切断が起こる.この分子内反応はいわゆるin-line機構で起こる.すなわち,O2’,P,O5’が一直線上に並ぶ遷移状態を経由する.このときの2’-OH基,及びリン酸残基の活性化などにマグネシウム残基が必要とされている.ハンマーヘッドの触媒コアの中において,N₇を除くいかなるヌクレオチドに変異を導入しても,その結果として解離活性が10^-3以下に低下する.ヌクレオチドを特異的に修飾し,リボザイムの活性が測定された例が多数報告されている.基質の結合の特異性は,ステムIとIIIのおけるワトソン-クリック塩基対によって決定されているため,活性を下げるようなリボザイムコア内での修飾は,基質の結合よりもむしろ,触媒作用に影響するためと考えられている.ただし,活性についての影響は,3次元構造全体の崩れと,または遷移状態の不安定化とのどちらでも発生しうる.本研究では,半経験的分子軌道法を用いてハンマーヘッド型リボザイムの反応解析を行うための分子モデルを提案し,これを用いてリボザイム変異体のRNA切断活性の変化をk_relを予測し,実験値との比較を行い,リボザイム変異による活性の低下の原因が遷移状態の不安定化であるのか,金属イオンの位置変化や3次構造の崩れなどの要因であるのかを検討した.リボザイム分子モデルはall-RNA hammerhead ribozymeの結晶構造(PDB code:1MME)を基に, methyl hydroxyethyl phosphate(MHEP)と修飾したリボース環の部分を半経験的分子軌道法のPM3法を用いて構築した.連続する2つの素反応(リボザイムの閉環とP-O結合切断)について,原子間距離を反応座標として,反応経路計算を行い,反応プロファイルを得た.反応プロファイルのは平均18kcal/molで,実験より得られている22kcal/molに近い値を得た.野生型リボザイムと変異型リボザイムの反応プロファイルからk_rel[calculation](＝exp())を算出し,実験値であるk_rel[experiment](＝)との比較を行った.2’水酸基の修飾については,A6のリボースの変異でk_rel[calculation]がk_rel[experiment]に近い値をとり,最も遷移状態の安定化に寄与していると考えられる.

Table.2’-水酸基を修飾したリボザイムにおける触媒活性の変化

　RNAを加水分解するリボヌクレアーゼの活性部位には2個のimidazole基がある.反応の第一段階として,imidazole基は塩基触媒としてRNAのリボースの2’位の水酸基からプロトンを引き抜き,生成した求核性の2’位の酸素原子がリン酸エステルのリン原子に結合して環状リン酸エステルを生ずる.第二段階として,この環状リン酸エステルが位置選択的に開裂する際に,イミダゾール基は一般酸触媒としてプロトンを酸素原子に供給する.この第二段階目の反応を再現する人工酵素として,2つのimidazole基を持つ-cyclodextrin 6,6’-bis(imidazoles)が合成されている.環状リン酸エステルを分子内にもち,-cyclodextrin 6,6’-bis(imidazoles)に結合し加水分解される分子として,4-tert-butylcatechol cyclic phosphateが用いられる.本研究では,この2つの分子と水分子との反応系を半経験的分子軌道法を用いて構築し,反応プロファイルを得た.またこの基質分子が-cyclodextrinに結合する位置を変化させた場合のエンタルピー変化から,エンタルピー的に最も安定な位置を得た.-cyclodextrin 6,6’-bis(imidazoles)には3つの異性体(AB,AC,AD)が存在し,AC体,AD体に比べてAB体が最も大きな活性を示している.AB体では2つのimidazole基が隣接しており,プロトンが結合していないimidazole基(A位)は水分子からプロトンを引き抜き,もう一方のimidazole基(B位)に結合しているプロトンは,環状リン酸エステルの遊離の酸素原子と3’位の酸素原子との両方に水素結合できる位置にある.一方,AC体,AD体では距離的に3’位の酸素原子とのみ水素結合できる位置にある.imidazole基(A位)が水分子からプロトンを引き抜く反応過程で,imidazole基(A位)の炭素原子に結合している水素原子が2’位の酸素原子と水素結合している構造が得られたが,これはimidazole基によりリン酸近傍で水分子がプロトンを引き抜き可能な位置に固定されていると考えられる.以上本研究により,-cyclodextrinを基本構造にもつ人工リボヌクレアーゼの加水分解の素反応の反応プロファイルが得られ,反応に適したimidazole基と基質分子の相対位置が明らかになった.これは-cyclodextrinを用いた新たな人工リボヌクレアーゼなどの人工酵素の開発に寄与することが期待される.