Synechococcus7942株においてはdnaK相同遺伝子についてはまだ報告がなかったので、その単離を試みた。その結果、3つのdnaK相同遺伝子が存在することが分かり、これをdnaK1、dnaK2、dnaK3と命名した。3つのDnaKは保存性の高いN末端側のATP結合領域と保存性の低いC末端側のペプチド結合領域から成るが、中でもDnaK3は顕著に長いC末端非保存領域を持っており、分子量も84kDaとHsp70としては例のない大きさであるのが特徴的である。また、DnaK2とDnaK3には葉緑体や他のラン藻由来のHsp70に特徴的な配列が存在しており、系統樹を作成した結果からも、この2つが葉緑体型と近いことが明かとなった。Hsp70は真核生物ではマルチジーンファミリーを形成し、細胞質、核、ミトコンドリア、小胞体、葉緑体といった様々な細胞小器官に分布し、多様な機能を発揮していることが知られている。しかし、同一空間に複数個存在するシャペロンの機能的特異性についてはまだ明らかになっていない点が多い。

　3つのDnaK蛋白質の機能の違いを解析するため、C末端側の非保存領域を利用して特異的な抗体を作製し、熱ショックによる3つのDnaK蛋白質量の変化をパルスラベルと、ウェスタンブロットにより調べた。DnaK1は合成量では明確な変化は見られなかったが、蓄積量は減少し、熱ショックにより分解されている可能性が考えられた。DnaK2は熱ショックにより合成量、蓄積量ともに増加し、典型的な熱ショック応答を示した。また、DnaK3は合成量、蓄積量ともに変化は見られず、熱ショック後も一定のレベルが保たれていた。これらの異なる様式での変動は3種のDnaKが異なる発現調節機構、および分解過程を持つことを示唆している。

　大腸菌ではDnaKの過剰生産により細胞分裂が阻害され、結果として細胞が伸長する現象や、増殖期に依存して生育に阻害的になるなど、興味深い現象が知られており、性質も比較的よく研究されている。そこでSynechococcus 7942株の3つのdnaK相同遺伝子を大腸菌に導入し、機能の比較を行った。大腸菌野生株内で大量発現させるとdnaK1,dnaK2では細胞の伸長が見られた。dnaK3ではあまり伸長はしないが、細胞に異常な形態が見られた。大腸菌dnaK温度感受性変異株において発現させると、dnaK2の発現は非許容温度での増殖を相補した。これに対し、dnaK1,dnaK3の発現では相補できず、逆に過剰発現により許容温度における生育が阻害された。このように、各dnaK相同遺伝子の発現が大腸菌に異なる影響を及ぼすことは、3つのDnaK蛋白質が異なる性質を持つことを示唆している。

　同一空間で合成される3つのDnaK蛋白質が役割分担をしている可能性を調べる手がかりとしてS.7942株の細胞を細胞壁、細胞質膜、チラコイド膜、細胞質、の各画分に分画し、各DnaK蛋白質の細胞内局在性を調べた。その結果、いずれのDnaK蛋白質も細胞質に最も多く存在していたが、DnaK3はDnaK1,DnaK2に比べてチラコイド膜への局在画分が顕著に多かった。アルカリ抽出、プロテアーゼ処理により、局在の形態を調べたところ、DnaK3はチラコイド膜の細胞質側に表在していると考えられた。チラコイド膜に結合しているHsp70は高等植物の葉緑体を含めても初めての例である。DnaK3の長いC末端非保存領域(C-terminal fragment:CTF)は特徴的なランダムコイル構造をとっていることが予測される。CTFとチラコイド膜局在との関係を調べるため、種々のキメラ蛋白質を構築し、その細胞内局在性を調べた。その結果、チラコイド膜局在には、CTFではなく、ペプチド結合ドメインに相当する領域が関与していることが示唆された。

　各dnaKの生育への必須性を調べるため、構造遺伝子中にカナマイシン耐性遺伝子を挿入することにより遺伝子破壊をこころみた結果、dnaK1は通常の生育には必須ではないが、dnaK2とdnaK3は生育に必須であると考えられた。また、dnaK3の発現量はdnaK1,dnaK2に比べてかなり少ないと考えられたが、過剰に発現させると、生育が阻害される現象も見られ、その発現は微妙に調節されているものと思われる。DnaK3のCTFの欠失による生育への影響は見られなかった。また、ATP結合領域をDnaK1,DnaK2のものに置き換えたキメラ蛋白質は、細胞内局在性においてはDnaK3同様にチラコイド膜への局在が見られたが、DnaK3の必須性を相補することはできず、DnaK3の必須な機能にはATP結合領域とペプチド結合領域の相互作用が必要である可能性が示唆された。

　dnaK2とdnaK3がともに生育に必須であることから、互いに特異的な機能を担っている可能性が考えられる。そこでDnaK3の基質に対する特異性を解析する目的で、C末端側のペプチド結合ドメイン以降にPCRによりランダムに変異を入れ、温度感受性変異株の取得を試みた。その結果、野生株は生育可能な42℃で生育できなくなった株を取得することができた。さらに、それらからは、復帰変異株が得られ、染色体上の単一部位の変異によるサプレッサー変異であることを確認した。また、dnaK3の下流にはHsp70/DnaKの機能に必要不可欠であり、共同して働くことが知られているHsp40/DnaJファミリーをコードする遺伝子(以下dnaJ⁷⁹⁴²とする)が存在しているが、これについてもHsp40ファミリー間で保存され、Hsp70との相互作用に必須であることが知られているJドメイン内に変異を持つ4つの温度感受性変異株を得た。

　dnaK3の下流に存在するdnaJ⁷⁹⁴²は生育に必須でありながらも過剰発現は生育に阻害的であることや、チラコイド膜への局在が顕著であることなど、DnaK3と性質の上でも似ており、両蛋白質が共同して働き、特異的なシャペロン機能を担っている可能性が考えられた。そこで、DnaK3とDnaJ⁷⁹⁴²との相互作用の可能性を酵母のtwo-hybridシステムを用いて調べた。その結果、DnaK3とDnaJ⁷⁹⁴²の組み合わせで活性が見られ、両蛋白質が相互作用している可能性が示された。DnaK2とDnaJ⁷⁹⁴²の組み合わせでも非常に弱い活性が見られたが、DnaK3-DnaJ⁷⁹⁴²に比べるとあきらかに低く、また、DnaK3と大腸菌のDnaJ、および、大腸菌のDnaKとSynechococcus7942株のDnaJ⁷⁹⁴²の組み合わせではまったく活性が見られなかった。このことから、DnaK3とDnaJ⁷⁹⁴²間の相互作用に特異性がある可能性が示唆された。

　以上、本研究により、シアノバクテリアSynechococcus sp.PCC7942に3つのdnaK相同遺伝子(dnaK1,dnaK2,dnaK3)が存在し、各DnaK蛋白質が異なる機能を持つことが示唆された。なかでもDnaK3はDnaK2とともに生育に必須であること、チラコイド膜へ比較的多く局在していることを明らかにした。さらに、オペロンを構成し、やはりチラコイド膜への局在が見られるDnaJ⁷⁹⁴²と特異的に相互作用している可能性を示唆した。分子シャペロンの機能の多様性と特異性の解析が課題となっている現在、これらがどのような特異的機能を持つのかは大変興味深く、その解析は有意義であると思われる。