出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、分泌糖蛋白質は小胞体においてポリペプチド鎖が膜透過した後、アスパラギン残基にN型糖鎖のコア部分およびセリン、スレオニン残基にO型糖鎖の一部が付加され、その後のゴルジ体に相当するオルガネラ間を輸送される過程でマンノースの付加を受け、高マンノース型の糖鎖構造となって細胞表層へと分泌される。現在までにゴルジ体における外糖鎖の付加過程については、段階的にそれぞれ特別な糖転移酵素を用いて行われるであろうことが、それぞれのステップに欠損のある変異株の解析から示されているが、その過程に関わる糖転移酵素やその活性発現を制御する因子の同定はまだまだ遅れている。また、出芽酵母においてゴルジ体の機能発現に関与する因子については詳しく研究されておらず、外糖鎖付加過程に必要な因子について解析することは、糖鎖付加の起こるゴルジ体そのものの機能の解析にも寄与するところが大きいと考えられる。

　以上をふまえて、当研究室の榊原らはBallouらの報告を基に、5mMのバナジン酸に対する耐性化を指標として9相補群に属する糖鎖不全変異株を取得した。これらの変異をvanadate resistance and immature glycosylationの頭文字を取ってvig変異と命名した。本研究では、新規の相補群に属する2群のvig変異株については野生型遺伝子をクローン化して解析を行い、機能未知であった3群のVIG遺伝子についてはそのコードする蛋白質の生化学的解析を行った。

　vig9変異株では、N糖鎖およびO糖鎖が野生株における成熟型とER型の中間程度の分子量であることが、分泌糖蛋白質であるインベルターゼやキチナーゼの分子量をそれぞれ比較することによってわかった。また他の形質として、シクロヘキシミドやジェネティシン(G418)に対する感受性の上昇が観察された。そこで、vig9変異株に酵母ゲノミックライブラリーを導入した後ジェネティシンに対する耐性を獲得した形質転換体を選択し、プラスミドを回収することによりVIG9遺伝子を含むDNA断片を得た。サブクローニングを行った後塩基配列を決定した結果、この配列中には361アミノ酸から成る新規の蛋白質をコードするORFが含まれていた。この蛋白質は全長にわたって親水性でありシグナル配列や膜を貫通していると考えられる領域はなかった。また遺伝子破壊株は致死的であり、この遺伝子は酵母の生育に必須であった。さらに、ホモロジー検索の結果からこの蛋白質は、糖リン酸とヌクレオチド三リン酸から糖ヌクレオチドを合成するような細菌の蛋白質と相同性が高いことが分かった。このことより、Vig9蛋白質は糖鎖合成の際の基質となるGDP-マンノースの生合成を行うGDP-マンノースピロホスフォリラーゼであると予想された。そこで、[-³²P]GTPとマンノース-1-リン酸を酵母ライセートの可溶性画分とインキュベートし、GDP-マンノースの生成量を野生株、変異株、多コピーでVIG9遺伝子を持つ株で比較した。その結果、野生株と比較して、変異株ではGDP-マンノースの生成量が非常に少なく、多コピー株では上昇していた。また、Vig9が活性調節因子ではなく、酵素本体であることを示すためGSTとの融合蛋白質を大腸菌を用いて発現、精製した。これを酵母ライセートの代わりに系に加えてもGDP-マンノースが生成されたことから、Vig9蛋白質はGDP-マンノースピロホスフォリラーゼそのものであると結論した。vig9変異株ではこの酵素の活性が非常に低いために糖鎖の基質であるGDP-マンノースの供給量が減り、その結果糖鎖不全となると考えられる。

　vig4変異株ではN糖鎖、O糖鎖ともに小胞体型より少し大きい程度であることが、やはりインベルターゼやキチナーゼの分子量をそれぞれ比較することによってわかった。また他の形質として、シクロヘキシミドやジェネティシンに対する感受性の上昇がvig9変異株同様観察された。そこで、vig4変異株に酵母ゲノミックライブラリーを導入した後ジェネティシンに対する耐性を獲得した形質転換体を選択し、プラスミドを回収することによりVIG4遺伝子を含むDNA断片を得た。サブクローニングを行った後塩基配列を決定した結果、この配列中には337アミノ酸から成る新規の蛋白質をコードするORFが含まれていた。疎水性解析の結果から、この蛋白質は4〜6回膜を貫通していると考えられる疎水性領域をもっていた。この蛋白質の局在を見るために蛋白質のC末側にmycタグをつけ酵母内で発現させ、間接蛍光抗体染色法により観察を行った結果ドット状の染色像を示しゴルジ体に局在すると考えられた。ショ糖密度勾配遠心法によりオルガネラの分画を行った結果からもこれは支持された。また一方ホモロジー検索から、Vig4は我々とほぼ同時期に発見された酵母のVrg4/Van2と同一の分子であり、Leishmania donovaniのLpg2と相同性が高いことがわかった。Lpg2はゴルジ体においてGDP-Manを細胞質側から内腔へと輸送するトランスポーターで、酵母ホモログであるVig4はGDP-Manトランスポーターであると考えられた。この変異株ではGDP-Manをゴルジ体内腔へ輸送できないために、糖鎖不全の形質を示すと考えられる。

　VIG1,VIG3,VIG6はそれぞれVAN1,ANP1,MNN9と同一であることが相補テストから明らかとなった。これらの遺伝子によってコードされる蛋白質の一次構造は、どれもN末側に膜貫通領域を一つもち、お互いにホモロジーの高い領域をそれよりC末側にもつというものである。N糖鎖に欠損があるという点で変異株の形質もよく似ている。ところがこれらの蛋白質の機能についてはほとんどわかっておらず、興味がもたれたためその解析を行うこととした。

　まずはこれらの蛋白質の生化学的解析を行うため、各々に対する抗体を作製した。抗原としてHis×6のタグを付加した蛋白質を大腸菌で大量発現させた。この際発現のために膜貫通領域を含むN末の領域は除いた配列を用いた。一方で全長のC末にmyc×6のタグを付加して発現するようなプラスミドを構築し、これを酵母内で発現させた。酵母ライセートを遠心分画したところ、これらの蛋白質は主に100,000gの沈殿画分に存在した。これは膜をTritonX-100の様な界面活性剤で処理しない限り可溶化されない。また、膜の外側からプロテアーゼ処理を行った結果から、膜貫通領域よりN末側の短い領域が細胞質側に、C末の大部分の領域が内腔側に存在するII型の膜蛋白質であることがわかった。更にこれらの膜が細胞内のどのようなオルガネラに対応するかを調べるため、ショ糖密度勾配遠心法による分画を行い、ウェスタンブロッティングを行ったところこれらの蛋白質は、ゴルジ体の画分に存在することがわかった。

　これらの蛋白質の局在を細胞レベルで明らかにするために、間接蛍光抗体法により細胞を染色した。その結果、タグのついた蛋白質を発現させるためのプラスミドとして低コピーのものを用いた場合は、ドット状の染色パターンを示し、ゴルジ体に局在しているものと考えられた。ところがプラスミドを多コピー状態にしたり、更にプロモーターを強い構成的なGAPDHプロモーターに変えた場合、これらの蛋白質は小胞体に蓄積することがわかった。これらの蛋白質が何らかの複合体を形成して細胞内で存在し、バランスが崩れると分泌経路に乗ることができずに小胞体に蓄積してしまっていると考えられる。

　以上の事実及び界面活性剤を加えても一部しか膜から可溶化されてこないということから、これらの蛋白質は細胞内で大きな複合体を形成しているものと予想された。そこでこれらの蛋白質の免疫沈降を行い蛋白質複合体の単離を試みた。mycタグのついた蛋白質を発現させた細胞からライセートを1%TritonX-100存在下で調製し、抗myc抗体を用いて免疫沈降、電気泳動した後、銀染色を行ってそのパターンを比較した。また、抗Vanl,Mnn9抗体を用いてウェスタンブロッティングをおこなった。その結果、Vanlの複合体にはMnn9は含まれているがAnplは含まれておらず、Anplの複合体にはMnn9はやはり含まれているがVanlは含まれていないということがわかった。つまり、細胞内にはVanl-Mnn9複合体とAnpl-Mnn9複合体が存在することがわかった。また更に、バンドを切り出してプロテインシークエンスを行った結果、糖転移酵素とホモロジーのあるHoclという蛋白質が含まれていることがわかった。遺伝子の変異株が糖鎖不全の形質を示すことを考え合わせると、これら複合体は糖転移複合体として機能していると予想される。そしてそれは、長い間不明であった-1,6-結合による外糖鎖のバックボーンを合成する反応であろう。二つの複合体が存在する理由としては、連続的な異なる反応を行う、または異なる基質に対する反応を行うためと思われる。ゴルジ体の糖転移酵素群には今まで単独で機能するものしか発見されていなかったが、新たに複合体として機能するものが加えられた。

　以上のように、本研究ではvig変異を相補する遺伝子をクローン化し解析することにより、酵母ゴルジ体における糖鎖付加の機構に関与する因子を明らかにした。それは糖鎖の前駆体を合成し、ゴルジ体内腔に輸送し、そして最終的に酵母特有の大きな外糖鎖を付加させる因子であると考えられる。この研究を更に進めることにより、酵母における糖鎖付加の機構を含めたゴルジ体の詳細な機能を明らかにすることができるものと期待される。