リポタンパク質の内膜遊離反応を詳細に解析するためには、タンパク質膜透過反応などの様々な反応と区別して単独で調べる実験系が必要である。ところが野生型Lppを用いてスフェロプラストからの遊離反応を解析する場合、Lppの合成(タンパク質膜透過反応)と遊離は共役させることが必要であり、合成後はすみやかに遊離しなくなった。この原因は、内膜上に蓄積したLppがホモ3量体を形成し、LolAとの複合体形成能を失うためであると考えられた。そこでLppに点変異を導入し、3量体を形成しにくいと考えられる変異体Lppを7種作製した。野生型と変異体のLppをスフェロプラストでそれぞれLolA非存在下で発現させ内膜上に蓄積させた後に、LolAを添加し内膜からの遊離を調べた。その結果、野生型はLolAによってほとんど遊離しなかったが、7種のうち6種がLolAによって内膜から遊離した。その中で、10番目のLeuをProに置換したLppL10Pは比較的安定であったので以下の解析に用いた。

　LppL10Pの内膜遊離反応をright-side out膜小胞で解析できる実験系の構築を試みた。内膜にLppL10Pを蓄積したスフェロプラストからright-side out膜小胞を調製した。LolAを添加しても、この膜小胞からLppL10Pの遊離は観察されなかった。ところがATP存在下でright-side out膜小胞を調製した場合、LolAに依存してLppL10Pは効率よく遊離した。ATPの非加水分解アナログや呼吸基質のみを用いた場合にはLppL10Pの遊離はみられなかったことから、プロトン駆動力ではなくATPの加水分解エネルギーがこの反応に必須であることが明らかとなった。

　right-side out膜小胞を用いた実験系において、LppL10Pの内膜遊離反応がタンパク質膜透過反応の阻害剤に対し非感受性であり、またATPと同程度の遊離活性がGTPでもみられた。これらのことから、内膜遊離反応にはタンパク質膜透過因子以外の未知の因子が関与していると考察した。この未知の因子の同定を進めるため、プロテオリポソームを用いた内膜遊離反応の再構成を試みた。in vitroの転写、翻訳によって調製した前駆体LppL10Pを膜小胞存在下に成熟体に変換した。成熟体LppL10Pと別途に調製した内膜を界面活性剤-オクチルグルコシドで可溶化し、大腸菌リン脂質に組み込むことでプロテオリポソームを再構成した。ところがATPの存在下においても、LolAによるLppL10Pのプロテオリポソームからの遊離はほとんど観察されなかった。そこで、プロテオリポソーム調製時に大腸菌の細胞質画分を添加したところ、LppL10Pは効率よく遊離した。再構成した遊離反応もATPとLolAに依存しており、この再構成実験系によってLppL10Pの膜小胞からの遊離には、ATPの加水分解エネルギー、細胞質因子、内膜因子、およびLolAが必要であることが明らかとなった。また、right-side out膜小胞ならびに再構成プロテオリポソームを用いた実験系においてLolA依存で遊離したLppL10Pが、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによってLolAと1:1の複合体を形成していることが明らかとなった。

　内膜遊離反応はP型ATPaseの阻害剤として知られるバナジン酸によって阻害された。再構成実験系を用いて、内膜遊離反応に働く細胞質因子の精製を行った。部分精製した細胞質因子のN末端5アミノ酸の配列は無機ピロホスファターゼ(PPase)のものと一致した。PPaseを枯渇させた菌株、あるいは大量発現させた菌株から調製した細胞質画分を用いたところ、PPase活性の増減とLppL10Pの遊離活性の増減との間に相関が見られた。さらに、市販の酵母PPase標品を用いても同様の活性を観察することができた。一方、PPaseにATP分解活性はなかった。これらのことから、LppL10Pの内膜遊離反応に関与する細胞質因子はPPaseであり、ATP要求性は膜因子によるものであると思われる。

　LppL10Pを用いた解析によって、細胞質因子と内膜因子(仮にLolCと呼ぶ)が外膜リポタンパク質の内膜からの遊離に関与することが明らかとなった。さらに細胞質因子がピロリン酸を2分子のリン酸に加水分解する酵素、PPaseであることが明らかとなった。これまでPPaseが外膜リポタンパク質の内膜遊離反応に関与することは知られていないのでたいへん興味深い。これらの因子が内膜側に存在しているからこそ、外膜リポタンパク質とLolAとの可溶性複合体は内膜からのみ形成可能であり、決して外膜から行われることはない。すなわち外膜リポタンパク質の一方向的な局在化が可能となると考えられる。細胞質でATPを加水分解することによって得たエネルギーを使って、内膜因子LolCが細胞質のPPaseと協同的に機能する。あるいは、P型ATPaseと考えられるLolCのリン酸化-脱リン酸化サイクルにPPaseが働くという推論も可能であると思われる(図2)。LolCとPPaseの機能により、内膜に存在する外膜リポタンパク質のLolAへの受け渡しがペリプラズムで行われていると考えられる。

図2 大腸菌外膜リポタンパク質の内膜遊離機構のモデル内膜上で成熟体となった外膜リポタンパク質(Lpp)は仮想の内膜ATPase、LolCの働きで内膜を遊離し、LolAと可溶性複合体を形成する。PPaseはLolCのリン酸化サイクルを調節しているのかも知れない。