ラットnCL-2cDNAをプローブとしてマウス遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行なった結果、約4×10⁵の独立的なプラークから8つの陽性遺伝子クローンを単離した。その結果、01xSSC/0.1%SDSの条件でラットのnCL-2cDNAと強くハイブリダイズした7つはすべてnCL-2遺伝子クローンであると同定されたが、残る一つ、204はハイブリダイズする強度が他の7つのクローンに比べて著しく弱かった。そこで、このクローンを詳しく解析した結果、少なくともカルパイン大サブユニットのエキソン3とエキソン5に相応する配列は同定できたが、これらの配列はnCL-2に相当する配列とは有意に異なっていた。さらにエキソンが含まれている204の遺伝子DNA断片でバックスクリーニングを行ない、これと重複し、5’側に約5.8kbpぐらい延長しているクローン305を単離した。本研究により同定した遺伝子のエキソン3とエキソン5のアミノ酸配列を他の既知のカルパイン大サブユニットと比較すると、どれに対しても60-80%の相同性を示し、特にnCL-2に近いこともなかったことから204と305に含まれている遺伝子断片はnCL-2遺伝子ではなく、新しいカルパイン分子種をコードするものであると判明した。

　一方、後に明らかになるように、この分子種は発現が胃及び小腸など、主に消化器官に偏っているため、骨格筋、胃、脳に続く4番目の組織特異的なカルパインであることでnCL-4(novel Calpain Large Subunit-4)と命名した。

　前章で同定した新しい遺伝子クローンの実体を明らかにするため、これに相応するcDNAクーロンをマウス、ラット、ヒト胃のcDNAライブラリーから単離し、その一次構造を明らかにした。その結果、ヒトnCL-4は、最長のオープンリーティングフレームが690個のアミノ酸からなり、計算される分子量は79,095となった。また、他のカルパインと同様に四つのドメインで構成されており、これらと比較して大きな欠失やp94で見られるような挿入配列は存在しなかった。特に活性中心のシステイン、アスパラギン、ヒスチジンの周りの配列は他のカルパインに対して極めてよい相同性を示しており、全配列にわたってもよい相同性を示すことからnCL-4はシステインプロテアーゼであることが強く示唆された。カルシウムイオン結合領域のドメインIVには5つのEF-ハンドが存在しており、それぞれは他のカルパイン大サブユニット及び30KのドメインIV’のものによい相同性を示すことからnCL-4はカルシウムイオンに依存するシステインプロテアーゼであることが強く示唆された。

　特にnCL-4は哺乳動物の特定のカルパインに対して強い相同性が見られず、組織普遍的なカルパインにも、組織特異的なカルパインにもほぼ等しい相同性(約50-55%)を示していることから、既知のカルパインのアイソフォームではなく、新しいカルパイン分子種であることが確認された。一方、異種間においても約90%前後の高い相同性を示すことから長い進化過程において他のカルパイン大サブユニット同様によく保存されていることが判明し、生理的重要性が強く示唆された。

　ノーザンブロット解析よりnCL-4は主に消化器管である胃や小腸において強い発現が認められることと同じ平滑筋である子宮では発現がほとんど見られないことから、消化器系の臓器において基本的かつ必須な役割を果たしていることが示唆された。

　胃にはnCL-2も強く発現しており、今後胃において両者の生理的役割に注目が集まる。

　nCL-4の組織特異的な発現様式から特定の遺伝的疾患と関連性が考えられ、その解析の第一報として、スタンフォードG3ラディエーションハイブリドパネルを用いて染色体マッピングを行なった。その結果、nCL-4遺伝子はヒト染色体1番のGD BLocus225またはSH GC-30183の付近に位置することが明らかとなった。

　ヒトnCL-4遺伝子はCOS-7細胞に過剰発現させると、蛋白質として安定に発現し、p94のような早い自己消化は起こらないことが判明した。しかし、その細胞破砕液をウエスタンブロットすると可溶性画分には検出できなかった。一方、nCL-4を過剰発現した細胞を抗体染色すると核やそのまわりが強く染色された。nCL-4には核移行シグナルや膜結合部位などは存在しないことから、過剰発現によるミスロカリゼーションである可能性も考えられた。

　ラット胃の組織切片をnCL-4に特異的な抗体により免疫蛍光染色した結果、胃底腺領域において強いシグナルが認められ、nCL-4が胃で大事な機能を果たしていることが強く示唆された。特に、胃の壁細胞に多く分布していることから塩酸の分泌など胃の特殊な機能に関連している可能性を示唆した。

　Bac-to-Bac^TMバキュロウイルス発現系nCL-4の生化学的及び酵素学的性質を調べた。その結果、リコンビナントヒトnCL-4は酵素活性の上では普遍的カルパインと類似していることが判明した。カルシウムイオンに対する感受性はニワトリの/mカルパインのものに近く、カルパインの特異的阻害剤で阻害された。特に活性発現には普遍型カルパインの制御因子、30Kを必要とし、生体内においても30Kとの相互作用が強く示唆された。しかし他の普遍型カルパインに比べると温度感受性は極めて特殊であり、また、自己消化パターンにおいても他の組織普遍的なカルパインで見られるような中間産物は生成されず、自己消化の速度も他の普遍的カルパインより遅いことを考え合わせるとnCL-4の酵素学的特性は巨視的には普遍的カルパインと類似しているが、微視的にはかなり特殊な性質をもっていることが判明した。この点はカゼインを基質にした比活性からも示唆されており、その比活性が他の普遍的なカルパインより極めて低いことから一層限定的に細胞内蛋白質を分解し、細胞内情報伝達系などにおいて必須かつ特殊な機能を担っていることが示唆された。今後天然型nCL-4を精製し、比較の必要があると考えられる。