リンパ系組織はCDV感染における主要標的組織の一つであり、また持続感染に関与していると考えられている。本章では野外感染例のイヌについて、近年利用できるようになった抗イヌリンパ球抗体を用いた免疫組織化学的手法により、脾臓およびリンパ節での標的細胞サブセットの同定と、リンパ球の消長や分布などの変化について検討した。臨床的に呼吸器症状と神経症状を示し、重篤なCDV感染症と認められた仔イヌ3匹から、全身臓器のホルマリン固定パラフィン包埋標本と、脾臓およびリンパ節の凍結標本を作成した。病理組織検索では全身臓器にCDV感染に特徴的な病変がみられ、これらの病変部にウイルス抗原陽性像を認めた。凍結標本の二重染色の結果、脾臓ではCD4陽性リンパ球の減少がみられ、ウイルス抗原は主にCD4およびThy-1陽性リンパ球や細網内皮系の細胞に認められ、また、CD8、CD21、IgM陽性細胞にも認められた。白脾髄の壊死は主に瀘胞に存在していた。リンパ節においてはThy-1陽性領域は比較的保持されていたが、二次瀘胞の形成は認められずB細胞の反応が抑制されていることが示された。これらの結果よりCDVはT、Bリンパ球に直接感染して、その減少を引き起こすとともに、主要標的細胞と考えられたTリンパ球への感染が、リンパ球の減少や分布に影響を及ぼすことが示唆された。これらの現象はCDVが宿主の免疫応答の阻害に関与していることを示唆しており、その阻害機序の解明に有用な知見が得られたと思われる。さらに、CDVの持続感染機構の解明の糸口ともなると考えられた。

　近年、日本においてワクチン接種犬でのジステンパー発症例が相次いで報告されている。また、アメリカやヨーロッパでもジステンパーの流行が報告された。そこで、第2章では近年の野外発症例から分離されたCDVについて、その抗原解析ならびにH蛋白遺伝子解析を行った。ジステンパー症状を呈したイヌの末梢血由来単核球と、B細胞由来の培養細胞であるB95a細胞との混合培養により分離された3株の野外ウイルス株(Ueno株、Hamamatsu株、Yanaka株)について、B95a細胞で継代したワクチン株(Onderstepoort株)を対照としてウイルス抗原の解析を行った。間接蛍光抗体法では顕著な差は認められなかったが、免疫沈降法ではOnderstepoort株の分子量が78kDaであったのに対し、野外株は84kDaと異なる値を示した。Tunicamycinを用いて糖鎖付加を阻止すると、Onderstepoort株、野外株ともに68kDaを示した。H蛋白遺伝子の塩基配列から予測されるアミノ酸解析においては、N-linkの糖鎖付加可能部位がOnderstepoort株は4ケ所、野外株は9ケ所と異なっていた。以上の結果から、野外にはH蛋白性状の異なるCDVの存在することが示唆された。さらに、他のCDV株との遺伝的距離を比較したところ、日本で分離した3株間のホモロジーは約99%と高く1つのクラスターを形成し、また日本の野外株と外国の野外株とのホモロジーも約95%と高い値を示し、これら野外株は1つの大きなクラスターを形成した。しかし、全野外株とワクチン株とのホモロジーは低く異なるため別のクラスターを形成した。このことから、ワクチン株とは異なる野外株が、世界的に流行していると考えられた。

　第3章では他の膜糖蛋白であるF蛋白についてYanaka株とOnderstepoort株の性状を比較検討した。F蛋白の免疫沈降法による電気泳動度にはYanaka株とOnderstepoort株間に顕著な差は認められなかった。Yanaka株の塩基配列を決定し、その塩基配列から予測されるアミノ酸配列を解析した結果、親水性領域、システイン残基、N-linkの糖鎖付加可能部位は全て保存されており、Onderstepoort株とのホモロジーは95.7%と高かった。これらの結果から、野外株におけるF蛋白の変異はH蛋白より少ないことが明かとなった。さらに、近年の野外株の一つであるPDV-2と、Yanaka株、Onderstepoort株について遺伝的距離の比較を行ったところ、PDV-2とYanaka株は近く、Onderstepoort株は遠いという結果が得られ、F蛋白解析においてもワクチン株とは異なる野外株によるジステンパーの流行説が支持された。第2章と比較し、吸着に関与するH蛋白に、より顕著な変異が認められたことから、流行の原因解明においてH蛋白の抗原性状解析および機能解析が必要と考えられた。

　第2章、第3章において野外株のH蛋白に顕著な変異が認められたことから、H蛋白の抗原部位の解析を進めるため、MAbを用いて各ウイルス株との反応性を検討した。1977年の野外株(MD77株)を免疫原として、ワクチン株(YSA-TC株)に対する中和活性を指標に作製されたMAb7種から、免疫沈降法によりH蛋白を認識するものを3種同定した(JD-5、JD-7、JD-11)。これらの抗体と従来の抗H MAb1種(d-7)を用いて、Onderstepoort株、ワクチン株、および5種の近年の野外株との反応性を比較した。d-7、JD-5、JD-11は蛍光抗体法、免疫沈降法および中和抗体価において全ての株とよく反応したが、JD-7はワクチン株との反応性は高かったものの、野外株とは低い反応性を示した。この結果は、近年の野外株において、H蛋白のJD-7認識部位に変異が起こっている可能性を示唆している。また、H蛋白遺伝子のdeletion clonesを作製し、これらのMAbの認識する抗原部位を検索した。JD-5およびJD-7は現行のH蛋白発現系では反応性が低く、抗原部位の検索は出来なかった。しかし、d-7およびJD-11はH蛋白遺伝子全長cloneの発現系とは強く反応したが、deletion clonesのそれとは反応しなかった。この結果から、この2種のMAbはH蛋白遺伝子塩基配列の1609-1836番目を認識しているか、またはこの部分を必要とする高次構造によって表出する部位を認識していると考えられた。

　ジステンパーはヒトの麻疹と同様に終生免疫を誘導する疾患で、体内でウイルスの持続感染がおこっていると考えられているが、持続感染部位やその機構などは不明である。そこで第5章では、CDV感染の標的細胞であるリンパ球系の細胞を用いて、ウイルスの持続感染機構を検討するために、持続感染ウイルス株を作出し、性状解析を行なった。Bリンパ球由来の株化細胞であるB95a細胞に、CDV・Yanaka株を感染させ、生残、増殖した細胞を約20代継代した。この細胞はYanaka株感染初期に認められた細胞変性効果(CPE)を示さず、非感染細胞と同様の増殖性を示した。継代日数100日を超えた時点で、免疫沈降法によりF蛋白およびH蛋白の検索を行なったところ、両蛋白とも発現が認められた。さらに10種のMAb(抗NP、H、F)を用いた蛍光抗体法でも全てに反応が認められ、本細胞にはウイルスが持続感染していると考えられた。この細胞からウイルスを回収し、新たにB95a細胞に感染させてもはCPEをほとんど示さず、ウイルスによる細胞死も観察されなかった。しかし蛍光抗体法、免疫沈降法によりウイルスの感染および増殖が確認出来た。このことから、本ウイルス株をCPEや細胞死を引き起こさないCDV持続感染株、Yanaka-BP株と命名した。Yanaka-BP株膜蛋白の塩基配列を解析し、予測されるアミノ酸配列をYanaka株と比較したところ、H蛋白のアミノ酸変異は4ヶ所、F蛋白では6ヶ所認められた。特にF蛋白遺伝子においては、Onderstepoort株でin vitroで開始コドンとして使われていると考えられている3番目のATGコドンがATAに変異していた。この変異の持続感染への関与は明らかではないが、Yanaka-BP株は今後の持続感染の機序の解明に有用であると考えられる。

　本研究の成績は世界的なジステンパー流行の要因の解明や伝播経路の研究に多大な知見を与え、膜蛋白の機能の解明にも寄与すると考えられる。また、本研究で得られたCDV持続感染株は、終生免疫やウイルスの持続感染機構を解明するために有用な実験系を提供すると考えられる。