実験にはマウスの膵臓外分泌腺を酵素処理して得られた単離細胞を用いた。Ca²⁺画像はパッチピペットから負荷したBTCを二波長励起して得られた蛍光画像を冷却CCDカメラで記録し、その蛍光比を求めることにより得た。

　膵臓外分泌腺細胞の開口放出のCa²⁺親和性は、パッチクランプ法の膜容量測定法で開口放出を測定しながらケイジドCa²⁺試薬を用いることによってを求めた。膜容量測定法は細胞膜面積当たりの膜容量を一定と仮定して電気的に膜容量を計測することによって、開口放出の結果として起こる膜面積の変化を求める方法であり、現在のところ開口放出を最高の時間分解能で定量的に測定できるシステムである。また、ケイジドCa²⁺試薬は紫外線を照射するとCa²⁺に対する親和性が低下し、細胞全体に均一かつ瞬時に、Ca²⁺濃度上昇を与える事が可能となる。このような性質をもつケイジドCa²⁺試薬に様々な濃度のCa²⁺を含ませることにより、Ca²⁺ジャンプの大きさを調節した。

　これまでの実験系において使用されてきたfura-2などのCa²⁺指示薬はCa²⁺に対する親和性が高く、測定するCa²⁺濃度が大きくなるにつれ正確なCa²⁺濃度測定が困難になる。なぜならば、得られたレシオ(R)を[Ca²⁺]₁＝Kd’(R-Rmin)/(Rmax-R)というGrynkiewicz,Poenie,Tsienの式(JBC、1985)でCa²⁺濃度に換算する際には、Ca²⁺濃度が高いと分母である(Rmax-R)の項が0に近づくので正確にRmaxを求める必要がある。ところでRmax、Rmin、Kd’などの定数は電解質液中と細胞内で異なることが知られており、細胞内でキャリブレーションを行う必要があるが、この際Rmaxはそもそも求め難い定数であり、実際細胞内のばらつきも大きい。したがって高親和性Ca²⁺指示薬であるfura-2で求めたのでは2〜3M以上のCa²⁺測定には信頼性がない。今回、低親和性Ca²⁺指示薬BTCを用いたことにより生理的条件下でRがRmaxに近づくことはなく、Rmaxの測定誤差がCa²⁺濃度推定に与える影響は少なく、より高いCa²⁺濃度を測定することが可能となった。

　単離腺細胞にアゴニストとして高濃度のACh(1M)を投与すると、腺腔端のいわゆるトリガー領域に始まるCa²⁺波動が観察され、トリガー領域においてはCa²⁺濃度の最大値が約10Mに達することが示された(マイクロモーラーCa²⁺スパイク)こうして得られたCa²⁺画像には更に二つの特徴がある。第一の特徴は、Ca²⁺波動の全時間経過を通じて腺腔端のトリガー領域におけるCa²⁺濃度が他の領域より高く、トリガー領域ではCa²⁺濃度が10Mを超えているのに対し、基底領域のCa²⁺濃度はトリガー領域のそれより常に2〜3Mほど低かった。第二の特徴はトリガー領域における強いCa²⁺上昇はアゴニストを投与し続けているのにも関わらず一過性であり、数秒後には刺激前のレベルに回復してくることである。しかしfura-2を用いたCa²⁺画像解析ではこれらの特徴が観察されなかった。二種類の親和性の異なるCa²⁺指示薬を用いて得られた結果の差異は、fura-2がCa²⁺に対して親和性が高いため(解離定数は約0.2M)、3M以上の高いCa²⁺上昇で色素が飽和していると考えれば容易に説明される。逆にBTCのCa²⁺画像解析の特徴はBTCが飽和していない事を示しており、BTCのCa²⁺親和性が低いこと(解離定数は約10M)やBTCによって求まった最大10MものCa²⁺濃度上昇が真実であることを裏付けている。

　ところで上記のBTCとfura-2によるCa²⁺画像解析の差異はそれぞれ別の細胞で測定していること、および各々のCa²⁺指示薬のCa²⁺に対するバッファ効果の差によって生じたという可能性がある。この可能性を排除するために同じ細胞にBTCとfura-2を同時に投与して解析することを試みた。この方法はBTCとfura-2が大きく異なる励起波長をもつことを利用しており、低濃度のCa²⁺はfura-2で、高濃度のCa²⁺はBTCで測定可能になる。しかしこの二色素四波長励起画像解析によって得られた結果においてもBTC画像のみにマイクロモーラーCa²⁺スパイクが観察された。この結果は二つの色素間で生じた差異は細胞間の差でもバッファ効果の差でもなく、色素の親和性の差によるものであることを示唆し、また、fura-2が飽和するような大きなCa²⁺上昇が起きているということを強く支持するものであった。

　一方、低濃度のアゴニストを投与した場合(50nMのACh)では、fura-2による画像解析ではトリガー領域から立ち上がり、基底領域に伝播していくCa²⁺波動を示したが、BTCによるCa²⁺画像解析ではほとんど変化が見られなかった。したがってこの細胞ではアゴニストの濃度が低いと1Mに達しない小さなCa²⁺上昇(サブマイクロモーラーCa²⁺スパイク)が起きることが二色素四波長励起画像解析によって初めて見出された。

　膜容量測定法とケイジド試薬を組み合わせて開口放出におけるCa²⁺親和性を求めたところ、膵臓外分泌腺細胞には異なる速度で分泌される二種類の開口放出が存在した。すなわちCa²⁺濃度上昇が5Mを超えて初めて観察される、遅延を持った遅い膜容量増大と、さらに大きなCa²⁺濃度上昇(約10M)を与えたときに観察された、速い膜容量増大成分である。今回この膜容量測定法で得られた遅い開口放出のCa²⁺依存性は、streptolysin-Oなどで膜を透過型にした実験系において、amylase分泌には3M以上のCa²⁺上昇が必要であるという結論と一致し、whole-cell clampのような生理的状態に近い細胞においても、分泌顆粒の開口放出は低親和性であることが示された。

　これらのCa²⁺上昇が膵臓外分泌腺細胞のもつ二つのCa²⁺依存性の細胞機能、つまり膜融合による酵素分泌とCa²⁺依存性チャネルの活性化による電解質輸送との対応を検討するために、膜容量測定とBTCを用いたCa²⁺画像解析を同時に行うことによって調べた。その結果、高濃度のACh(1M)を投与し、トリガー領域でのCa²⁺濃度が10Mに達するような場合には大きな膜容量変化がすぐに観察された。これに対し、低濃度のACh(50nM)を投与した場合では、トリガー領域のCa²⁺濃度上昇が5Mに達しないときには膜容量変化は起こらなかった。しかし低濃度のAChで刺激し、Ca²⁺濃度が1Mに達しない時においても大きな二相性のCl^-電流は活性化され、第一相の一過性の電流はトリガー領域にCa²⁺濃度上昇が観察されると同時に現れるので、腺腔膜のCl^-チャネルの活性化であると考えられるのに対し、二相目の電流はCa²⁺波動が基底側に広がって初めて現れるので基底膜のCl^-チャネルの活性化であると考えられた。この二相性のCl^-電流の活性化は電解質輸送に重要であると考えられており、いわゆるpush-pull機構によって電解質輸送が起こることを追認したものである。つまり、サブマイクロモーラーCa²⁺スパイクでは溶液輸送が選択的に引き起こされ、開口放出は、トリガー領域でのマイクロモーラーCa²⁺スハイクによって選択的に引き起こされることが証明された。また、この三つの状態はアゴニストの濃度依存的に変わり、アゴニスト濃度が高くなるほど、開口放出が起きる確率が高くなると考えられた。