メサンギウム細胞におけるSMemb発現の、腎組織像と腎機能の予後に対する意義を、ヒトIgA腎症の臨床データを用いて検討する。

　対象:IgA腎症45例。

　1)糸球体組織障害とSMemb発現の関係:全症例の全糸球体489個を連続切片で観察した。糸球体の組織障害(メサンギウム細胞の増殖、糸球体硬化)はPAS染色で、メサンギウム細胞におけるSMembと-actinの発現は免疫組織化学を用いて、糸球体ごとに半定量的に評価した。メサンギウム細胞の増殖、糸球体硬化のそれぞれの程度(grade0-2/0-3)と、SMembと-actinの発現の程度(grade0-3)の関係を、non-parametric法で解析した。

　2)腎機能の予後とSMemb発現の関係:対象45例の中から、腎生検時の血清クレアチニン値が正常(1.3mg/dl以下)で、5年以上(平均8.6±1.5年)追跡可能だった24例を、予後良好群(血清クレアチニン値が上昇しなかった群、13例)と予後不良群(血清クレアチニン値が異常高値に上昇、あるいは血液透析導入となった群、11例)の2群に分けた。メサンギウム細胞におけるSMemb、-actinの発現を症例ごとに半定量的に評価し、先の2群間で、non-parametric法で比較した。また、各症例で追跡期間中の1/血清クレアチニン値(1/Cre)の月あたりの変化率を計算した。

　1)糸球体組織障害とSMemb発現の関係:メサンギウム細胞の増殖のgrade2の糸球体では、0、1の糸球体に比べ、有意にSMembの発現gradeが高値を示した(1.7±1.1vs.1.3±1.1,1.2±1.0、p<0.05)。-actinの発現gradeは、増殖のgrade2の糸球体で、0の糸球体に比べ有意に高値であった(1.2±0.8vs.0.9±0.8、p<0.05)。糸球体硬化のgrade2、3の糸球体では、0、1の糸球体に比べ、有意にSMembの発現gradeが高値を示した(1.8±1.1,2.1±1.0vs.1.1±1.0,1.3±1.0、p<0.05)。しかし、-actinの発現gradeは、異なる硬化のgrade間で有意差はなかった。

　2)腎機能の予後とSMemb発現の関係:症例毎に算出したSMembの発現スコアは、予後不良群では良好群に比べ有意に高値を示した(1.7±0.6vs.0.8±0.6、p<0.05)が、-actinの発現スコアは、2群間で有意差はなかった(1.2±0.6vs.0.8±0.5、ns)。1/Creの月あたりの変化率は、予後不良群では良好群に比べ有意に高値であった[(7.7±7.9)×10^-3dl/mg/月vs.(0.5±1.9)×10^-3dl/mg/月、p<0.05]。その値はSMembの発現スコアと有意な相関を示した(R＝0.5、p<0.05)が、-actinの発現スコアとは相関を示さなかった(R＝0.33、ns)。

　本研究により、SMembは細胞増殖あるいは細胞外基質の増加の見られるメサンギウム細胞に発現していることが示された。一方、-actinの発現はメサンギウム細胞の増殖とは関係していたが、細胞外基質との関係は明らかではなかった。この結果から、SMemb発現の意義は-actinとは異なっており、細胞外基質の蓄積と関係していることが推測された。

　臨床的には、予後不良群では良好群に比べ、SMembがメサンギウム細胞に強く発現していた。さらに、1/Creの変化率は、SMembの発現スコアと有意な相関を示した。しかし、-actinの発現と予後との間には、明らかな関係は見出せなかった。

　SMembのメサンギウム細胞での発現は、糸球体での細胞外基質の蓄積と腎機能の予後に関係していた。したがって、SMembを発現しているメサンギウム細胞は増殖し、細胞外基質をさかんに産生し、最終的に糸球体硬化に陥ると考えられる。

　SMembの細胞外基質との関係に注目し、基礎実験を行った。組織レニン・アンギオテンシン系は、細胞外基質の蓄積・糸球体硬化の進行との関係が注目されており、アンギオテンシンII(AII)は糸球体においてメサンギウム基質の産生を増加させることが報告されている。そこで、AIIによる培養メサンギウム細胞の刺激と、ラットへのAIIのin vivo投与を行い、糸球体のSMemb発現と細胞外基質の蓄積の関係を検討した。

　1)培養メサンギウム細胞におけるSMembの発現:ラット培養メサンギウム細胞を、AII(10^-6M)、TGF-(10ng/ml)、PDGF(BB,10ng/ml)、IL-6(5ng/ml)で0-48時間刺激した後、Western Blot AnalysisでSMembの蛋白発現を検討した。検出されたバンドの濃度をNIH image1.61で解析した。

　2)AII慢性投与による糸球体のSMemb発現:5週齢のSprague-Dawley(SD)ラット(オス、100g)の皮下に浸透圧ミニポンプを植え込み、AII(200ng/kg/min)または生理食塩水を14日間持続投与した。また、AT1受容体拮抗薬であるTCV116を10mg/kg/日または水を、連日経口投与した。ラットは以下の4群(各群6匹)に分けた:

　(1)コントロール群(生理食塩水を持続皮下投与、水を経口投与)

　(2)AII群(AIIを持続皮下投与、水を経口投与)

　(3)TCV群(生理食塩水を持続皮下投与、TCV116を経口投与)

　(4)AII+TCV群(AIIを持続皮下投与、TCV116を経口投与)。

　糸球体のSMembの蛋白発現は、免疫組織化学とWestern Blot Analysisで評価した。免疫組織化学では、糸球体ごとにSMembの発現を半定量的に評価した。免疫組織化学用の検体を採取した後、残りの腎組織からシービング法により糸球体を単離し、蛋白を抽出した。Western Blot Analysisを行い、NIH image1.61で解析した。

　また、糸球体蛋白中のファイブロネクチンの量を、酵素免疫法で測定した。

　1)培養メサンギウム細胞におけるSMembの発現:培養メサンギウム細胞では、無刺激でもSMembが強く発現していた。AII、TGF-、PDGF、IL-6刺激によるSMembの発現の増強は明らかではなかった。

　2)AII慢性投与による糸球体のSMemb発現:免疫組織染色では、AII群ではコントロール群に比べ有意にSMembの発現スコアが高値を示した(0.87±0.33vs.0.40±0.19,p<0.05)。AII+TCV群では、コントロール群との間に有意差を認めなかった(0.17±0.14vs.0.40±0.19,ns)。一方、TCV群では、コントロール群に比べ有意にSMembの発現スコアが低値であった(0.17±0.10vs.0.40±0.19,p<0.05)。

　Western Blot Analysisでも、AII群ではコントロール群に比べ有意にSMembの発現が増強していた(2.03±0.44vs.1.00±0.49,p<0.05)。

　糸球体のファイブロネクチンの量は、AII群ではコントロール群またTCV群に比べ、有意に増加していた(302±207 ng/5g protein vs.96±81 ng/5g protein,94±86 ng/5g protein,p<0.05)。また、SMembの発現の強い個体ではファイブロネクチンの発現も強い傾向があった(R＝0.30,ns)。

　本研究で、in vivoのAII慢性投与により、糸球体細胞は形質転換し、SMembを発現することが示された。この効果はAT1受容体拮抗薬により抑制された。また、AII投与により、SMembとともに細胞外基質のファイブロネクチンも増加した。

　培養メサンギウム細胞では無刺激でもSMembが強く発現するため、刺激後の変化は検出されなかった。これは、培養によって細胞が増殖型に形質変換するためと考えられる。

　In vivoでAIIをラットに投与すると、糸球体のSMemb発現が増強した。この時SMembは、メサンギウム細胞に強く、一部上皮細胞にも発現していた。この効果は、AT1受容体拮抗薬で抑制されたため、AT1受容体を介した作用と考えられる。

　In vivoのAII投与は、糸球体のSMemb発現と同時にファイブロネクチンの発現も増強させた。また、SMembの発現の強い個体ではファイブロネクチンの発現も強い傾向があった。

　AIIは、AT1受容体を介してメサンギウム細胞の形質変換を促し、SMembとファイブロネクチンの発現を増強した。