血管内皮細胞(ECs)から数種の血管作動性物質を産生し、血管平滑筋細胞(VSMCs)の収縮、弛緩や増殖を制御する。その中でnitric oxide(NO)は血管拡張作用を有し、VSMCsの増殖を抑制する。従って、NOの産生異常は高血圧及び動脈硬化の発症に重要な役割を果たす。また、NOの産生はECs内のCa²⁺シグナルによって制御され事が知られている。G蛋白質を細胞内信号伝達に用いる場合、典型的なCa²⁺の経時変化は各種の刺激によりまず細胞内Ca²⁺(Ca²⁺_i)濃度が急速に上昇し、peakに到した後、徐々に下降する。最初のpeakはIP₃-induced Ca²⁺ release(IICR)を介する細胞内ストアからのCa²⁺放出で、下降相(sustained phase)は細胞外からのcapacitative Ca²⁺ entry(CCE)で構成される。しかし、両者のどちらがNO産生に重要なのか不明である。放出されたNOの正確な定量が難しく、また従来NO-donorの作用は不確定であるため、NOの産生量とVSMCs内のCa²⁺動態の関係も不明であった。

　NO産生時のECs内Ca²⁺シグナルとNOの産生量、共存培養してECsに隣接するVSMCs内Ca²⁺動態に及ぼす影響を解明する。

　1)牛大動脈から分離したECsとVSMCs細胞株(A7r5)を単独又は共存培養し、4種の異なった細胞内信号伝達系を有する刺激物質、即ちATP(10M)、bradykinin(BK,100nM)、ionomycin(IM,50nM)またはthapsigargin(TG,1M)を両細胞に加え、刺激前後個々のCa²⁺_i濃度変化を二次元画像法で解析した。2)ECs内Ca²⁺動態を定量するため、peakの濃度、peak後の下降相の半減期およびCa²⁺動態の時間積分を測定した。3)同時に刺激後培地中に放出されるNOの代謝物質NO₂をchemiluminescence法で測定した。更に、4)NO₂濃度と薬理作用を検討するために、NOのbioassayを実施した。即ち、共存培養のECsから産生されたNOによって隣接するVSMCs内Ca²⁺濃度の動態を上記の二次元画像法解析を用いて定量観測した。

　(1)NO産生の経時変化:ATPとBKは刺激後3分間でNO生産が安定化し、IMは20分後に定常化した。TGは40分まで増加した。対照実験で刺激物質を加えなくても培地中のNO₂が軽度増加した。(2)Ca²⁺流入量とNO産生量との影響:上記4種の刺激物質とも、NO産生量は細胞外に生理的な濃度のCa²⁺が存在した時増加し、その量はTG>IM>ATP>BKの順番に減少した。細胞外のCa²⁺をEGTAでchelate又は細胞内へのCa²⁺流入をNi²⁺で遮断するとNO産生量は著明に減少した。(3)単独培養のECsとVSMCsのCa²⁺_i反応:ECsでは4種の刺激物質とも細胞外にCa²⁺が存在した時にCa²⁺_i濃度は増加し、peakの値はBK>ATP>IM>TGの順番に減少した。細胞外Ca²⁺をEGTAでchelate、又はCa²⁺流入をNi²⁺で遮断した結果、4種の刺激物質ともCa²⁺_iのpeakレベルは不変で、下降相の半減期及びCa²⁺_i濃度の時間積分値が減少した。ところがVSMCsでは、ATP、TGやIMはCa²⁺_iを増加させたが、BKによる増加分は少なかった。(4)共存培養のECsとVSMCsのCa²⁺_i,反応:4種の刺激物質ともECsでは共存培養でも単独培養でも同様にCa²⁺_i濃度を増加させたが、共存培養ではVSMCsのCa²⁺_i濃度を逆に低下させた。その低下程度とECsからのNO産生量は良く相関し、TG>IM>ATP>BKの順であった。Indomethacin又はglybenclamide前処理では全くVSMCsのCa²⁺_i動態に影響が認められなかったが、l-NMMA(500M)の前処理でCa²⁺_i濃度の低下は阻止された。これは共存培養のVSMCsのCa²⁺_i反応がNOにより修飾された事を示す。(5)l-arginineの結果:ECsの単独培養で、特に刺激物質を加えなくとも高濃度のl-arginine(5mM)はNO産生を促進した。且つこの促進作用は細胞外のCa²⁺有無に影響されなかった。共存培養でl-arginineはECsのCa²⁺_i濃度を軽度に低下させ、VSMCsのCa²⁺_i濃度を大幅に低下させた。(6)NO産生量とECsのCa²⁺_i動態の関係:NO産生量はCa²⁺_i上昇のpeak後の下降相の半減期(r＝0.90)及びCa²⁺_i濃度時間積分(r＝0.86)とは良い指数関係を示した(p<0.001)。

　ECsからのNO産生量は持続性Ca²⁺流入で決められ、そのNOは隣のVSMCs-のCa²⁺_iの下げる程度を濃度依存的に制御する。高濃度の基質があれば、ECsのCa²⁺が増加しなくてもNOは産生される。

　前報で、CCEはNO産生に重要であることを証明した。その時のECs内IICR-のNO産生過程における生理的意味は不明である。産生されたNOはautocrine作用でECs自身のCa²⁺を下げ、細胞内IICRに影響する。一方、ECsの細胞膜上の数種の受容体に対するagonist、G蛋白質及PLCなどの特異的なantagonistが少なく、また各々の細胞に選択的に使用できないため細胞間の比較ができない。従って、NOのautocrine-作用を正確に評価する事が難しかった。NOがECs自身のCCEに及ぼす影響について全く不明である。

　(1)ECs内IICRのNO産生過程における意義を解明する。(2)IICRを抑制してNOのautocrine作用を正確に定量する。(3)産生されたNOがIICRとCCE-に及ぼす影響を検討する。

　(1)牛大動脈から分離したECs、VSMCs(A7r5)及CHO細胞を培養した。(2)ヒトの1(IP₃R₁)、2(IP₃R₂)、3(IP₃R₃)型IP₃受容体のC末にあるCa²⁺channel domainに対する特異的なpeptide抗体(IP₃R₁Ab,IP₃R₂Ab,IP₃R₃Ab)を作りaffinity chromatography法で精製し、immunoblotting法で特異性を確認した。(3)IP₃R₁Ab-又はheparin(MW＝5.000)を個々のECs内にmicroinjectionし、IICRを抑制した後、ATP-の刺激に対する個々のCa²⁺_i濃度上昇の動態を二次元画像法で解析した。(4)NO₂^-の代謝物質NO₂を前報と同じ方法で測定した。(5)抗体等の操作を加えていない細胞をATP、BK(500nM)またはTGで刺激する過程のCa²⁺_i濃度上昇とMn²⁺quenching-における内因性NOと外因性NO donorの修飾作用をSpex Fluorologで記録した。

　(1)ECsではIP₃R₁しか存在しないことをimmunoblotting法で示した。又、ECsを10-60Mのryanodineで前処理した後、caffeine(3-60mM)に対して弱いCa²⁺_i反応(最大7%の上昇)をしか示さず、Ca²⁺-induced Ca²⁺ releaseの機構は重要でないことを確認した。(2)Normal IgGと抗体のvehicleに用いたhigh-K⁺bufferをmicroinjection-した細胞はATPに対するCa²⁺_i反応が全く影響されなかった。又、30分後に二回目のATP刺激を行い、初回と同様のCa²⁺_i反応が示された。IP₃R₁Ab(0.1〜10mg/ml)をECs-にmicroinjectionした後、ATP刺激を行うとIICRとCCE両者の反応が抑制された。Microinjectionされた細胞はIM又はTGに対して正常な反応を示し、microinjectionによる細胞傷害は起こさないことを示唆した。(3)小量のheparinで軽度IICRを抑制し、Ca²⁺_iの上昇は遅くなり、CCE段階のCa²⁺_i濃度は低下した。多量のheparinでATP刺激後のIICRを完全に抑制し、更にCa²⁺_iを基線以下-51%位まで低下した。L-NMMA(1mM)前処理でCa²⁺_i濃度を低下させず、基線以下まで低下したCa²⁺_i濃度はATP刺激後、周囲の細胞から放出されたNOによることを示唆した。(4)IICRを特に修飾していない細胞をl-NMMAで前処理すると、ATP又はBKの刺激で産生した内因性NOがIICRを20%程度まで抑制した。内因性NOをl-NMMAで抑制した後、更に外因性NO-donorを加え、内因性NOの機能を再現することができた。非常に興味有る事に、NOがCCEを上昇させる作用をもち、その作用はMn²⁺ quenchingの記録からも証明した。L-NMMAとG-kinase遮断薬、LY83583、はCCEを抑制させ、逆にNOR-3(30〜300M)とBr-cGMP(1mM)はCCEを亢進させたことから、NOのCCEを促進する機構がG-kinaseを介することを示唆した。(5)TGでCCEを促進すると、大量のNOが産生された。そのNOの産生がl-NMMAの前処理で完全に抑制された。

　IP₃R₁を介するIICRはCCEの誘発とその後のNO産生の重要なstepである一方、NOの強いautoerine作用を部分的に緩衝する。NOとCCEの間にはpositivefeedback-の機構が存在する。この事から前報のCCEによる大量のNO産生が説明される。NO-はIICRを抑制し、CCEを促進することでECsのCa²⁺_i濃度の急速な変化を緩衝することが示された。