食塩感受性高血圧とは食塩過剰摂取により血圧が上昇するタイプの高血圧である。その成因として腎臓におけるNa排泄能の障害が関与すると考えられている。臨床的にみて血圧の食塩感受性は遺伝的素因に大きく影響される。従ってその遺伝子レベルでの異常の解明は、高血圧の発症予知や進展抑制という意味で非常に重要と考えられる。しかし現時点では特殊な疾患(Liddie症候群、グルココルチコイド反応性アルドステロン症、apparent mineralocorticoid excess症候群など)においてのみ遺伝子異常が明らかにされているにすぎず、既報の遺伝子のみでは食塩高血圧の詳細な分子機構は未だ説明できない。

　本研究においては、以上の問題意識に基づき、食塩感受性高血圧の病態に関与する候補遺伝子を探索することを目的とした。

　ヒトの高血圧は多因子遺伝で、成因が不均一で、かつ遺伝因子と環境因子の相互作用により発症するためアプローチが難しい。これに比しモデル動物における解析は、homogeneousな系であり環境因子をコントロールしやすいといった利点を有する。食塩感受性高血圧のモデル動物としてはDahlラットが広く用いられている。すなわち、Dahl食塩感受性(DS)ラットは高食塩食で飼育すると高血圧を呈するのに対し、Dahl食塩抵抗性(DR)ラットでは血圧は上昇しない。また、Dahlラットにおいても腎交換移植実験などからその病因に腎臓が重要と考えられている。そこで今回の研究では主にDahlラットの腎臓を用いて解析を行った。

　高血圧に関与する遺伝子探索の戦略としては、(i)高血圧動物とそのコントロールを交配させたF₂世代の動物において血圧と相関を示す遺伝子多型性マーカーを検索する方法、(ii)生理機能や遺伝子操作動物の表現型などの従来の知見に基づき、高血圧への関与が予想される物質に関して解析を行う方法、(iii)高血圧動物とコントロール動物とで発現量の異なる遺伝子を検索する方法、などが考えられる。このうち(i)は最も基本的かつ信頼性が高い方法であるが、これのみでは作業能率が低く実際的ではない。むしろ最初の段階では(ii)または(iii)にて候補遺伝子のスクリーニングを行い、その後(i)のアプローチにて遡及的に確定するのが妥当と考えられる。

　今回の研究では、(ii)のアプローチとして具体的には、病態生理上その関与が予想されるNa利尿ペプチド系および酸化LDL系の遺伝子の解析を行った(以下研究1、2)。しかしこのアプローチはあらかじめ候補を絞ることが不可欠であり、現時点で予想外もしくは未知の遺伝子は同定できないという欠点を持つ。これを補うのが(iii)のアプローチであり、本研究では特にdifferential display法を用いた解析を行った(以下研究3)。

　differential display法とは、実験群に特異的に発現している遺伝子を対照群との比較により同定する、発現量の差に基づく遺伝子クローニング法である。研究3では本法をDahlラット4群の腎臓mRNAに応用して、食塩感受性群と抵抗性群、高食塩食群とコントロール食群の間で発現量に差のある遺伝子の同定を通して原因候補遺伝子の同定を試みた。

　DS0.3%,DS8%,DR0.3%,DR8%の腎臓mRNAをRNAarbitrarily-primed PCR法にて増幅し、電気泳動にて4群間で差のあるバンドよりcDNAを回収し、その塩基配列を既知の登録配列と比較した。発現量の差はノーザンブロット法にて確認し、新規クローンについてはcDNA libraryのスクリーニングにて全長塩基配列を決定した。

　その結果、4群間で発現量に差のある3種のクローンが得られた。クローン1は高血圧ラットの既知の原因候補遺伝子とされるS_A遺伝子と同一で、その発現はDSで亢進しており、食塩負荷にて減少した。クローン2はneurotrophin-3受容体(trkC)遺伝子の一部と同一で、発現量はDR・DSともに食塩負荷にて減少した。クローン3は新規遺伝子であって、アセチルコリン受容体7遺伝子の3’非翻訳領域と90%のホモロジーのある部分を含み、DSで発現が亢進していた。in situ hybridizationでは、腎臓の近位尿細管に特異的に発現していた。この遺伝子の全長配列を決定したところ、レトロウイルスのpol遺伝子相同部分、逆転写酵素が作用する際のprimer binding siteを含み、両端にlong terminal repeat(LTR)様配列を有する新規レトロポゾンであることが判明し、REPT1(rat retrovirus-like element transcribed in proximal tubules)と命名した。

　本研究にてS_Aという既知の原因候補遺伝子が同定されたことより、このアプローチの有用性が示されたと考えられる。またtrkC及びレトロポゾンの高血圧への関与は従来報告がなく今回の結果は高血圧研究に新展開をもたらしうる知見であると考える。ことにレトロトランスポゾンは、ある種の疾患の原因になっていることが近年明らかになり注目を集めている。血友病、筋ジストロフィーなどの遺伝病、腫瘍などの原因であるのみならず、心血管系領域でも急性心筋梗塞とACE遺伝子中のレトロトランスポゾンの有無が相関を示すことが報告された。さらにごく最近、I型糖尿病の原因遺伝子がIDDM_k1.222というレトロポゾンであることが報告されたが、pol遺伝子産物の系統樹により、今回同定したREPT1遺伝子はIDDM_k1.222に非常に近縁であることが明らかになり、これら疾患の予想外の類縁関係を示唆するものとも言えよう。

　以上、食塩感受性高血圧のモデル動物を用いた解析により、その病態にNPR-C,LOX-1,S_A,trkC,REPT1が関与しうることが示された。

　本研究はあくまで食塩感受性高血圧に関与する遺伝子のスクリーニングとして位置づけられる。従って今後、上述のアプローチ(i)すなわち各遺伝子のgenotypeがF₂世代ラットの血圧値と相関するか否か、などのさらなる検討により食塩感受性高血圧における役割が明らかになっていくものと思われる。