1.ラット及びマウス神経系細胞初代培養

　神経細胞は、ラット及びマウス妊娠17日目の胎児海馬を切り出し、トリプシン処理により細胞を分離し、無血清培地での培養後、1週間ないし10日目に実験に用いた。

　アストログリアは、大脳皮質の混合培養系から、培養2週間目に継代培養を行い、単一細胞培養系を確立した後に用いた。ミクログリアも大脳皮質混合培養系から、培養2週間目に単離した後に用いた。

　2.PAFの定量法

　種々の刺激を加えた初代培養細胞を用い、培養上清及び細胞からBligh&Dyer法により脂質を抽出した後、ケイ酸カラムによりPAFを分画、粗精製した。定量は、PAFR高発現CHO細胞膜を用いたRadioreceptor assay法を用いた。

　1.ラット初代培養系を用いたPAFの定量と産生細胞の同定

　PAFは、主に神経細胞によりglutamic acid刺激で産生放出されることがわかった。特にNMDA刺激では、刺激後1分で最大となり、その後徐々に分解され、また用量依存的に産生された。アストログリア、ミクログリアからはほとんど産生されなかった。

　2.神経細胞におけるPAF産生の機構

　グルタミン酸受容体のうち、主にNMDA受容体を介して産生が誘導された。また、この反応はカルシウム依存的であった。

　神経系では、PAFは主要な神経伝達物質であるグルタミン酸により神経細胞で産生、放出され、直ちに分解されることがわかった。しかも、強い脱分極により機能するNMDA受容体を介していることは、脳内での、痙攣、虚血などの病因の際に、PAFが産生されることを支持する。PAFは、病変部において多量に産生され、炎症、神経細胞死を誘導する因子である可能性が高い。また、LTPの際にシナプスでPAFが産生され、逆行性伝達物質として働いている可能性も示唆する。既に、我々は、脳内にPAFRが存在することを報告しているが、さらに細胞レベルでの検討を要すると考えられた。

　1.PAFRの遺伝子レベルでの解析

　Wistar ratの全脳を切り出し、凍結切片を作成し、in situ hybridization及び免疫組織化学法を用いて、PAFRの局在とその細胞同定を行った。さらに初代培養系により、神経、アストログリア、ミクログリア細胞を培養後、mRNA抽出し、PAFR probeを用いてNothern blotting,RT-PCRを行った。

　2.PAFRの機能的受容体発現

　神経系細胞の混合培養系に対し、PAF刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇をFura2-AMによる蛍光標識を用いて画像解析し、機能的受容体を発現している細胞を同定した。装置はArgus 50(HAMAMATSU photonics)を用いた。さらにカルシウムイメージングと免疫組織染色により、細胞の種類を同定した。細胞特異抗体は、神経細胞に対しては、neurofilament-200、アストログリア、ミクログリアはそれぞれ、GFAP,OX42またはisolectin B4を用いた。

　1.in situ hybridization法によるPAFRの局在

　脳内では主に、海馬錐体細胞層、及び白質層に均一に分布する強いシグナルを得た。免疫組織染色により、これらは海馬錐体細胞とミクログリアであった。また胎児から成体まで、発現量に変化は見られなかった。

　2 Northern blotting,RT-PCRによるPAFRの局在

　優位にミクログリアに発現していることが判明した。

　3 ラット初代培養系を用いた機能的PAFRの存在(細胞内カルシウムイメージング)

　免疫染色との併用により、PAFに反応したミクログリアで細胞内カルシウム濃度の上昇が見られた。さらにPAFR knock out mouseから培養したミクログリアでは、PAFに対する細胞内カルシウム上昇は見られなかった。

　以上から、脳内ではPAFRは優位にミクログリアに発現していることが判明した。

　中枢神経系ではPAFRは、主にミクログリアに存在することが判明した。海馬錐体細胞にも、遺伝子レベルでの存在は見られたが、細胞内カルシウム上昇は見られず、受容体の膜への発現があるいは細胞内伝達系が異なる可能性がある。一方、PAFを介した神経ミクログリア相互作用が、脳内で存在することが示唆される結果となり、ミクログリアにおけるPAFの機能を検討した。

　1.細胞

　単離したミクログリアを、無血清培地で一晩培養した後にPAF刺激を行った。

　2.MAPキナーゼ(MAPK)の活性化

　PAFの細胞内シグナルを検討するため、MAPKの活性化をリン酸化によるgel shift assay及び32P-ATPの基質への取り込みにより検討した。さらに、MAPK familyのErk1&2の特異的キナーゼであるMEK1の阻害剤を用いて、chemotaxisシグナルへの影響を検討した。

　3.chemotaxis

　Boyden chamberおよびfibronectinコートしたフィルターを用いて、PAFおよび種々の薬剤の化学走化性に対する効果を検討した。

　4.cPLA2の局在

　MAPKにより活性化されるcPLA2の局在をNorthern blotting及びWestern blottingにより検討した。

　5.アラキドン酸及びグルタミン酸産生測定

　cPLA2により産生されるアラキドン酸(AA)放出を、3HラベルしたAAを取り込ませたミクログリアをPAF刺激した後に放出された量を定量しることにより検討した。グルタミン酸は、PAF刺激後の細胞上清を回収し、酵素法及びHPLCによるアミノ酸分析器を用いて測定した。

　1 MAPKの活性化

　ミクログリアにおいて、MAPK(Erk1/2)はPAFにより、2〜3分後に最大となる活性化を受けた。その活性化は、PAFR antagonist、百日咳毒素,MEK1阻害剤により抑制された。PAFRは、Gi型のG蛋白質を介し、MEK1,Erk1/2を活性化するシグナルを持つことが判明した。

　2PAFに対するchemotaxisとその機構

　ミクログリアはPAFに対してchemotaxisを示した。PAFR antagonist、PTX,MEK1阻害剤により、chemotaxisは阻害された。従ってミクログリアにおけるchemotaxisにはMAPK familyであるErk1/2の活性化が必要と考えられた。

　3.cPLA2とアラキドン酸産生

　MAPK(Erk 1/2)の基質の一つであるcPLA2は、mRNAおよび蛋白レベルでミクログリアに存在した。さらにcPLA2によって膜リン脂質から産生されるアラキドン酸はPAF用量依存的に、放出された。またこの産生はカルシウム依存的であった。

　4.グルタミン酸産生・放出

　ミクログリアからPAF刺激により、6時間で約2倍のグルタミン酸の放出が見られた。以上より、ミクログリアはPAFに対し活性化され、chemotaxisを起こすことが判明した。さらにグルタミン酸、アラキドン酸放出という新知見を得た。

　中枢神経系におけるPAFおよびPAFRの存在とその意義を検討した。PAFは主に神経細胞によりグルタミン酸刺激で産生され、さらにその主要な反応細胞はミクログリアであった。ミクログリアのchemotaxisにより、神経とミクログリア間の相互作用が考えられ、そこにはアラキドン酸産生など本来の機能の炎症細胞として働くことはもちろん、グルタミン酸を介した神経毒性が関係している可能性があり、非常に興味深い。

　中枢神経系においてその合成や受容体の存在が示唆されているPAFについて研究し、(1)産生細胞は主としてニューロンであること、(2)標的細胞は主としてミクログリアであり、化学走化性を示す、などの新しい知見を得た。