胸腺、リンパ節、脾臓の細胞から抽出したtotal RNAを用いてCD4mRNAの発現をノーザンプロットで解析した。胸腺細胞では正常マウスとほぼ同量のCD4mRNAが検出され、リンパ節、脾臓の細胞ではわずかながら検出された。この際、変異マウスで検出されたCD4mRNAは正常マウスと比較してサイズが短く思われた。このためRT-PCR法により胸腺細胞のCD4cDNAをクローニングし、正常マウスCD4cDNAの塩基配列との比較を行った。その結果、変異マウスCD4cDNAは膜貫通部位を含む第8エキソン全体(119bp)を欠損していることが明らかになった。

　さらにCD4mRNAで第8エキソンがなぜ欠落しているのかを調べるために変異マウスの肝臓由来のゲノムCD4遺伝子の塩基配列を解析した。その結果、第8エキソンと第8イントロンの接合部位14bpが1つのthymineに置き換わっていることが明らかになった。このゲ細胞表面にCD4分子が発現されないと考えられる。

　この変異マウスでは、CD4分子は細胞表面には存在しないが、膜貫通部位の欠失したmRNAが発現していることから分泌型として産生されている可能性があると考えた。そこでまずこの変異マウスCD4cDNAをサイトメガロウイルスのプロモーターの下流に組み込んだベクターを導入したCOS7細胞の上清中に可溶性CD4が分泌されるかどうかをELISAにより解析した。対照のベクターのみを導入した細胞の培養上清中には可溶性CD4は検出されなかったが、変異マウスCD4cDNAを組み込んだベクターを導入した培養上清中にはCD4分子が検出された。次に生体内にこの可溶性CD4が存在するかどうかを調べるために血清をELISAで調べたところ、変異マウスでは検出され、正常マウスでは検出されなかった。さらにSDS-PAGEでこの可溶性CD4を解析したところ、正常の膜型CD4が52kDaであるのに対して可溶性CD4は43kDaであり、塩基配列から予測される分子量(44.6kDa)とほぼ一致した。

　以上のことからこの変異マウスではCD4ゲノム遺伝子に変異があり、そのためCD4mRNAで膜貫通部位をコードするエキソン8が欠落し、その結果、細胞表面にCD4が発現されず、可溶性CD4が分泌されることが明らかとなった(図.1)。

　CD4遺伝子に変異のあるこのマウスではCD4陽性T細胞が存在せず、可溶型CD4が存在する。このことが免疫応答にどのような影響を与えるかをまず細胞性免疫の指標である遅延型過敏症(DTH)反応で検討した結果、正常マウスのDTH反応に比べて変異マウスでは有意にその反応が減少していた(図.2A)。次に液性免疫である抗体産生について検討を行った。まず何も免疫していない変異マウスの血清中のIgG抗体のサブクラス毎の量をELISAで調べたところ、正常マウスとほとんど変わらなかった。次に胸腺非依性存抗原であるTNP-Ficollで免疫したときの抗体産生を調べたところ、これについても正常マウスとほとんど変わらない、もしくはIgMではむしろ高い産生を示した(図.2B)。以上のことから変異マウスで抗体産生細胞であるB細胞は正常に機能することが示された。次に胸腺依存性抗原で免疫したマウスの抗体産生を調べた。IgMに関しては変異マウスにおいて正常マウスと同程度の産生が見られたが、IgGサブクラスについてはIgG1およびIgG3は正常マウスより少ないものの産生はみられ、IgG2aとIgG2bについてはほどんど産生がみられなかった(図.2C)。この抗体産生の減少を確かめるために胸腺依存性抗原である羊赤血球(SRBC)を用いて検討した結果、IgM、IgG共に減少が認められた。以上のことより、このCD4変異マウスではヘルパー機能が著しく減少していることが明かとなった。

　近年作製されたCD4ノックアウトマウスではCD4T細胞に代わり、ダブルネガティブ(DN)T細胞がヘルパー機能をもっており、抗体のクラススイッチにかかわっていることが示唆されている。私が発見したこのCD4変異マウスでもわずかながらヘルパー機能があるため、DNT細胞について解析した。このマウスのDNT細胞は抗CD3抗体で刺激するとB細胞の活性化、クラススイッチにかかわるCD40リガンドやインターロイキン4を発現し、ヘルパー細胞として機能している可能性が示唆された。