目的はCHSやSTSと相同性のある酵素なので、ホモロジーを利用したPCRによるクローニングを試みた。既知のCHSおよびSTSの間で相同性の高い領域の配列をもとに、縮重入りセンスプライマーを2種、アンチセンスプライマーを2種デザインし、合成した。アマチャの葉よりtotal RNAを抽出し、逆転写して得たcDNAを鋳型にPCRを行ったところ、4種の組み合わせのいずれにおいても、予想された大きさの断片が増幅された。サブクローニングして塩基配列を決定したところ、2つのグループ、HmC、HmSのみであった。5’-RACE、3’-RACEを行い、さらにRACE産物の配列情報に基づいて全長ORFの増幅を行った。これをシークエンシングし、HmCとHmSの全長ORF、約1.2kbpの塩基配列を決定した。

　HmCは、クズのCHSと86%の相同性を示し、アマチャのCHSと推測された。一方HmSは、クズのCHSと71%の相同性を示し、関連した酵素であることが考えられた。しかし、後述のHis169など、CHS、STSのコンセンサス配列と性質の異なるアミノ酸残基を持つ部分が12カ所見られ、また、他のものには見られない6残基のインサーションを有している。これらのことから、HmSは新たなPKSをコードしているものと推定された。

Fig.2.Alignment of deduced amino acid sequences of STS of Arachis hypogaea,CHS of Pueraria lobata,HmC and HmS

　HmCとHmSの機能を明らかにするため、全長ORFを大腸菌で発現させて酵素活性を検討した。全長を含むPCR産物を発現ベクターpET-32aに組み込み、チオレドキシンとの融合タンパク、TrxHmC、TrxHmSとして発現させ、ヒスチジンタグを利用して融合タンパクを精製した。

　酵素を1と2とともにインキュベートし、反応生成物を酢酸エチルで抽出、TLC及びHPLCで分析することにより酵素活性を検討した。TrxHmCの反応生成物中に、CHSの生成物であるnaringenin chalcone(3)が非酵素的に異性化して生成したnaringenin(7)が検出されたことから、HmCはアマチャのCHSの遺伝子であると同定できた。また、化合物A、B、Cが検出された。TrxHmSの場合、7、resveratrol(4)のいずれも検出されず、化合物A、B、Cだけが検出された。Intact HmS、酵母の系で発現させたHmSも同じ活性を示した。また、アマチャ葉より粗酵素液を調製して同様の反応を行ったところ、7の生成量が非常に低かったにもかかわらずかなりの量の化合物Aが検出され、原植物にも同じ反応を触媒する酵素が存在することが明らかになった。

　化合物A、B、Cの構造を明らかにするため大量反応を行い、生成物を分取HPLCで分離・精製し、¹H-NMRとMSにより構造を解析した。化合物CとBはそれぞれ、bis-noryangonin(8)とそのcisアイソマー(9)であると決定した。化合物Aは新規化合物4-hydroxy-6-[4-(4-hydroxyphenyl)-2-oxo-3-butenyl]-2H-pyran-2-oneであることが明らかになり、これを、p-coumaroyltriacetic acid lactone(10)と命名した。

　In vitroアッセイで検出された8と10は、対応するカルボン酸から非酵素的にラクトン化したもので、9は8が光による異性化を受けて生成したものと考えられる。つまり、HmSタンパクは、主生成物としてp-coumaroyltriacetic acid(6)を、副生成物としてp-coumaroylacetoacetic acid(11)を生成させる酵素だと考えられる。以上のことから、HmSは閉環反応を全くせず炭素鎖伸長反応のみを触媒して直鎖テトラケチドを遊離する新しいタイプのPKSの遺伝子である事が判明した。この酵素を、coumaroyltriacetic acid synthase、CTASと命名した。炭素鎖伸長反応のみに限定されたPKSがクローニングされたのはこれが初めての例である。

Fig.3.Enzyme activity of HmS(＝coumaroyltriacetic acid synthase,CTAS)

　酵素タンパクの構造と機能の関係を探るべく、数種のミュータント酵素を作製し、その活性を検討した。

　はじめに、炭素鎖伸長反応について検討した。カラシ(Sinapis alba)由来CHSとピーナツ(Arachis hypogaea)由来STSにおいて、スターターおよび伸長鎖が結合すると推定されているCysは、HmSではCys168、HmCではCys164に対応している。Cys168をSerに改変したHmS-C168Sを作製し、酵素活性を検討したところ、全く活性を示さなかった。CHSやSTSと同様、CTASにおいても、このCys168がスターターと伸長鎖の結合部位として機能していると思われる。

Fig.4.Function of His 169 in Hydrangea macrophylla CTAS

　次に、CHS、STSにおいて閉環反応に関与する構造、あるいは、CTASにおいて閉環を妨げている構造について検討することにした。まず、HmCとHmSを組み換えた数種のキメラタンパクを作成したところ、HmCのAla286、HmSのAla290の部分で組み換えたSC290は閉環産物を生産せず、HmSと同じCTAS活性を示した。この結果は、HmSの最大の特徴であるインサーションは閉環には関与していないこと、HmCでは閉環に関与している構造はAla286よりN末側の領域に存在することを示している。

　活性中心Cysの直後のアミノ酸は、全てのCHSにおいてPhe、STSではPheまたはTyrであるのに対し、閉環を行わないCTASにおいてはHisである。そこで、部位特異的変異導入により、CHSとCTASの間でこの位置のアミノ酸を交換した、HmC-F165H、HmS-H169Fを作成した。HmC-F165Hの活性は野生型と変わらなかったが、HmS-H169Fは野生型と異なる活性を示した。期待する新たな閉環産物の生成は検出されなかったものの、トリケチドである8の生成量が2.5倍に増加し、テトラケチドである10の生成量は1/4に減少した。CTASにおいては、His169が活性中心の構造維持に関与しており、変異によりその構造が変化し、トリケチドの加水分解の反応速度が3回目の縮合の反応速度より大きくなったものと思われる。

　第3章において、アマチャCHSに11と6を遊離する活性があることを見いだした。クズ(Pueraria lobata)由来のCHSとピーナツ由来のSTSについても検討したところ、これらの酵素も同じ活性を有することが明らかになった。

　さらに反応生成物を精査し、他の副生成物の検出を試みた。メチル化物のGC-MSにより、STSの反応生成物中に7を検出した。次に[¹⁴C]ラベル基質を用いたキャリアー希釈法により生成物が7であることを確認した。放射活性から、STSは本来の生成物である4に対して2.3%の7を生成させる活性を持つことが明らかになった。同様にCHSの副生成物として7に対して2.7%の4が生成していることを確認した。以上のように、CHSとSTSにおいて交叉反応が生じていることが初めて証明された。この交叉性が何に基づくものなのかは現段階では不明だが、活性部位構造の柔軟さ、あるいは、タンパク合成時にCHS型、STS型の2種のコンフォーマーが生成している可能性などが考えられる。

Fig.5.Cross reactions of chalcone and stilbene synthases

　CHSスーパーファミリーのうち主なものをもとに系統樹を作成したところ、CTASはビベンジル合成酵素(bibenzyl synthase、BBS)やアクリドン合成酵素(acridone synthase、ACS)と進化的に近いことが判明した。また、STSは独立のグループを作っていないこともわかった。これらのことと、第4章までで明らかにした酵素の性質から、CHSスーパーファミリーの分子進化の道筋を考察した。まず、スーパーファミリーの先祖はCTASと同じく閉環能力のない酵素であったと思われる。そして、CHSとSTSの直鎖テトラケチド遊離活性は、先祖の活性を完全には失っていないことを示していると思われる。この先祖型酵素が、まず閉環活性を獲得した後にACSとBBSが分化し、比較的最近になってCHSとSTSの分化が起こったと考えられる。CHSとSTSの交叉反応も、分化が完全に行われていないことの現れであると思われる。