ダンマレンジオールは、オキシドスクアレンがpre-chair-chair-chairのコンフォメーションをとり、エポキシドの開環により反応が開始され、段階的に環化反応が起きダンマレニル陽イオンが生成し、その後転移反応が起こることなく20位の陽イオンに水が付加し生成すると考えられている。これまでにダンマレンジオール合成酵素の酵素活性の検出は報告されておらず、まずP.ginseng毛状根におけるオキシドスクアレン閉環酵素活性について検討した。培養3週間目の毛状根より粗酵素液を調製し、[3-³H]-(RS)-2,3-オキシドスクアレンを基質としてTritonX-100を含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中、30℃、1時間反応を行い、生成物をシクロヘキサンで抽出後TLCで分離し、逆相HPLCにより対応する生成物の位置を分取してその放射活性を測定した。その結果ミクロソーム画分に3種類(サイクロアルテノール、-アミリン、ダンマレンジオール)の閉環酵素活性を検出した。生成したダンマレンジオールの20位の水酸基の配位については、逆相HPLCにおいて両ジアステレオマーが分離する条件(TOSOH ODS-80T_M,90%aq.CH₃CN)で各ピークに対応する位置を分取し放射活性を測定したところ、(20S)のフラクションにのみ活性が検出された。このことから、P.ginsengにおけるダンマレンジオール合成酵素は、真正サポニンと同じ20位の立体配置を有する(20S)-ダンマレンジオールのみを与えることが判明した。また、ダンマレンジオール合成酵素の諸性質を検討したところ、反応液中に界面活性剤の添加を必要とせず、また酸性側(pH6付近)で最も高い活性を示すなどこれまで報告されているオキシドスクアレン閉環酵素とは著しく異なる性質を示し、これが反応機構の違いを反映しているのか興味が持たれる。次に、各酵素の界面活性剤による可溶化を試みたが、いずれの閉環酵素も著しい活性の低下をもたらし、酵素の可溶化精製は断念せざるを得なかった。

Fig.1

　現在までにクローニングされているオキシドスクアレン閉環酵素は、いずれもステロールの骨格形成に関与する動物と酵母のラノステロール合成酵素と、植物のサイクロアルテノール合成酵素のみであり、トリテルペン合成酵素についてはクローニングの手がかりが全くない。そこで、「トリテルペン合成酵素はステロール合成酵素から分化してきたものであり、ステロール合成酵素とある程度相同性を持っている。」という仮定のもとに、現在までに知られているオキシドスクアレン閉環酵素間で生物種を越えて比較的よく保存されたアミノ酸配列がトリテルペン合成酵素にも存在することを期待し、相同性を利用したPCRにより本毛状根よりトリテルペン合成酵素のcDNAクローニングを行うことにした。ラノステロール及びサイクロアルテノール合成酵素間で比較的よく保存されている領域4ヶ所を選び縮重入り合成オリゴヌクレオチドプライマー(161S,463S,603A,711A)をデザインした。培養3週間目の毛状根よりRNAを抽出し、オリゴdTプライマーを用いて逆転写し、cDNAを調製した。これを鋳型として161Sと711Aで1回目のPCRを行い、463Sと603Aで2回目のPCRを行ったところ、450bpの生成物が得られた。この断片を大腸菌にサブクローニングし15クローンの配列を決定したところ、得られたクローンは3つにグループ分けすることができ、お互いに60%程度の相同性を示した。これらをPNX(9クローン)、PNY(3クローン)、PNZ(3クローン)と命名した(Fig.2)。一番多く得られたPNXは他種植物のサイクロアルテノール合成酵素と80%の相同性を示し、毛状根においてサイクロアルテノール合成酵素の活性が最も高かったことと併せてP.ginsengのサイクロアルテノール合成酵素のcDNAの一部であると考えられた。他の2種のクローンはこれらサイクロアルテノール合成酵素と60%の相同性を示し、トリテルペン合成酵素のcDNAである可能性が示唆された。

Fig.2

　ついで、これら3種類の全長の配列を得るべく各クローンに特異的なプライマーを用いた3’-及び5’-RACEを行い、各々翻訳開始部位及び終止部位を含む全長約2.3kbの配列を得た。次にこれら3種類の全長クローンを酵母の系で発現させることにより機能の同定を試みた。各々PCRにより全長に相当する断片を得た後、酵母の発現ベクターであるpYES2のGAL1プロモーター下流に導入し、これらのプラスミドを用いてラノステロール合成酵素変異酵母株GIL77を形質転換した。ガラクトースによる発現誘導を行い、収穫後菌体を破砕して粗酵素液を調製し、in vitroの酵素活性の検出を行った。PNXのクローンを導入した酵母では顕著なサイクロアルテノール合成酵素活性が検出され、PNXのクローンがP.ginsengのサイクロアルテノール合成酵素をコードしていることが明らかとなったが、他の2種のクローンではいずれも期待するin vitroの酵素活性が検出されなかった。そこで、これら形質転換酵母においてオキシドスクアレンの閉環産物が蓄積しているのではないかと期待し、形質転換酵母における生成物を精査した。ガラクトースによる誘導を行った後にリン酸緩衝液中で24時間培養を行い、菌体をアルカリ(20%KOH/50%EtOH)加熱後、ヘキサンで抽出した。その結果、PNYのクローンを導入した酵母において-アミリンの生産が確認(HPLC、NMR)され、このクローンがP.ginsengの-アミリン合成酵素をコードしていることが明らかとなった。一方、PNZのクローンはこの条件においても、閉環産物の生産を確認することができず、ダンマレンジオール合成酵素をコードしていると推測されるものの未だ機能の同定には至っていない。

-アミリン合成酵素とルペオール合成酵素のキメラ酵素の作製およびその解析

　最近になってデータベース上、シロイヌナズナ由来のトリテルペン合成酵素であるルペオール合成酵素cDNAの塩基配列が報告された。このアミノ酸配列とP.ginsengの-アミリン合成酵素の配列を比較すると全領域に渡って70%の相同性を示した。ルペオールの骨格生成反応は-アミリンの生成反応と途中まで全く同じメカニズムで進行するため、cDNAの配列上30%の違いが両化合物を作り分けていると考えられる(Fig.3)。これら生成物の作り分けが配列上どの領域に由来するのかを検討する目的で、両者のキメラタンパク質を上記の酵母の系で発現させ、その反応生成物を検討することにした。ルペオール合成酵素の全長クローンは報告された配列を基にプライマーをデザインし、シロイヌナズナより抽出したmRNAを逆転写して得たcDNAを鋳型としてPCRにより調製した。-アミリンとルペオール合成酵素の両者において全長をほぼ均等に2分する共通の制限酵素部位が存在したので、これを用いてキメラ体を構築し、先程と同様に形質転換酵母でのトリテルペンの生産を調べた。その結果、N末側半分を-アミリン、C末側半分をルペオール合成酵素の配列にしたキメラ体で-アミリンとルペオールが約3:1の比率で生成していることが分かった。さらに全長を4分割する制限酵素部位を用いて14種類のキメラ体を作製し、機能を調べたところ、N末より260番目から340番目のアミノ酸残基の領域が両化合物の作り分けに重要な領域であることが明らかとなった。

Fig.3 Mechanism Leading to Lupeol and -Amyrin

Fig.4

　P.ginsengから3種のオキシドスクアレン閉環酵素cDNAを得、酵母の系による発現からそのうちの2種がサイクロアルテノール合成酵素と-アミリン合成酵素をコードするものと同定した。これらのアミノ酸配列は60%の相同性を示し、これまで全く不明であったトリテルペン合成酵素は、サイクロアルテノール合成酵素と進化的にも近い関係にあることが明らかとなった。このことは、他のトリテルペン合成酵素のクローニングに道を開いたことを意味し、植物に存在する多種多様な骨格を持つ環状トリテルペンの生成機構の解明に向けて大きく展望を開いたと考えている。今後、有機化学と分子生物学の手法を融合し、ダンマランからオレアナンを経てフリーデラン骨格に至るまでのメチル基とヒドリドの転位機構、反応の終止におけるプロトンの引き抜き機構、等を明らかにしていきたいと考えている。

　Panax ginsengは生薬「ニンジン」の基原植物であり、その有効成分は種々のジンセノサイドと呼ばれるサポニンである。これらサポニンのアグリコンの骨格はオレアナンあるいはダンマラントリテルペンであり、対応するOSC生成物はそれぞれ-アミリンとダンマレンジオールである。

　そこでP.ginseng毛状根を材料としてこれら2種のトリテルペン合成酵素cDNAのクローニングを目指した。クローニングに先立ち、まず酵素タンパク側の情報を得るために酵素活性の検出と精製を計画した。

　P.ginseng毛状根より調製したミクロソーム画分においてOSCの酵素活性を測定したところ、これら2種のトリテルペンと植物ステロールの前駆体であるサイクロアルテノールの3種類の閉環酵素活性が確認された。ダンマレンジオール合成酵素活性の検出はこれが初めてであり、このとき20位の水酸基の立体化学は20Sであることが、逆相HPLCにより両異性体を分離する条件での検討により明らかになった。ミクロソームレベルで各酵素の特性化を行い、ダンマレンジオール合成酵素活性が界面活性剤の要求性、至適pHなどの点で既知のOSCとは際だった特徴を示すことを見いだしたが、酵素の可溶化が困難であったためその精製は断念せざるを得なかった。

　トリテルペン合成酵素に関しては何の手掛かりがないものの、現在までにクローニングされているOSC(ステロールの骨格形成に関与するラノステロールとサイクロアルテノール合成酵素のみ)では、生物種を超えてよく保存された配列が数カ所存在する。そこでトリテルペン合成酵素にもこれらの配列が存在することを期待し、相同性を利用したPCRによるcDNAクローニングを計画した。よく保存された配列4ケ所で縮重入りオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、毛状根より調製したcDNAを鋳型としてnested PCRを行ったところ450bpの断片が得られた。この配列を基に3’及び5’-RACEによりOSCと思われる全長クローン3種類を得ている。これらPNX、PNY、PNZと命名した3種の全長クローンを酵母の発現系で機能解析し、PNXはサイクロアルテノール合成酵素、PNYはトリテルペン合成酵素である-アミリン合成酵素をコードしていることを明らかとした。PNZはダンマレンジオール合成酵素をコードしていると推定しているが、未だ機能の同定には成功していない。-アミリン合成酵素であるPNYはサイクロアルテノール合成酵素と60%という高い相同性を有しており、トリテルペン合成酵素がステロール生合成に関与するOSCと進化的に非常に近い関係にあることを初めて明らかにした。

　最近になりデータベース上、Arabidopsis thaliana由来のルペオール合成酵素cDNAの配列が報告された。P.ginsengの-アミリン合成酵素と比較すると異なる生成物を与えるにも拘わらず、アミノ酸レベルで70%の相同性を示す。両化合物生合成のメカニズムは非常に類似しており(Fig.1)、配列上のどの領域がこれら化合物の作り分けに関わっているかを探るため、種々のキメラ体を作成しその生成物を解析することを計画した。

Fig.1

　全長をほぼ4分割する制限酵素部位を用いすべての組み合わせのキメラ体を作製し、酵母の系で機能発現させた。その結果N末側半分を-アミリン合成酵素、C末側半分をルペオール合成酵素の配列にしたキメラ1において、-アミリンとルペオールを3:1の比率で生成することを明らかにした(Fig.2)。さらに他のキメラ体の結果より、N末側から2番目の領域が-アミリンの生成に重要な領域であることが判明した。また、両酵素cDNAを鋳型に、N末とC末のプライマーを交互に用いてmixed PCRを行い、ランダムにキメラ体の作製を試みたところ、得られたキメラ体1クローンにおいて、-アミリンとルペオールを1:4の比率で生成することを見いだした。このクローンの配列を調べたところ、N末側が-アミリン合成酵素で、2番目の領域内の260番目のアミノ酸残基でルペオール合成酵素につなぎ変わったクローンであることが判明した。従って、260番から340番目までの80アミノ酸残基が-アミリンとルペオールの生成の比率を大きく変えている領域であることが明らかになった。OSCにおいて生成物の作り分けを行っている領域を特定したのはこれが初めての例である。

Fig.2

　以上本研究は、これまで未知であった高等植物のトリテルペン合成酵素cDNAのクローニングに初めて成功するとともに、多様なトリテルペン骨格の作り分けのメカニズムに関し重要な知見を得たものであり、これら遺伝子を導入したサポニン生産能改変型薬用植物の開発など幅広い応用が期待され、天然物化学、薬用植物学に寄与するところが大きく博士(薬学)の学位に値する研究であると認めた。