好中球にfMLPを添加するとメジウム中に活性酸素が放出されるが、この応答は、細胞膜透過性cAMPアナログのジブチリルcAMP、ホスホジエステラーゼ阻害剤の3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、あるいはアデニレートシクラーゼを活性化する受容体アゴニストのプロスタグランジン(PG)E₁の添加により、細胞内cAMPを増大させると抑制された。最も強い抑制は、IBMX存在下でPGE₁を添加した細胞において観察された。一方、プロテインキナーゼ(PK)Cを直接活性化するフォルボールエステル(PMA)も活性酸素を産生したが、この作用はcAMP増大の影響を全く受けなかった。すなわち、PKCより上流の機能蛋白質分子がcAMP依存的にリン酸化され、活性酸素産生の抑制を導くことが示唆された。PI3-Kの特異的な阻害薬であるワートマンニンとLY294002は、いずれもcAMPと同様に、PMAの効果に影響を与えることなく、fMLPによる活性酸素産生を完全に抑制した。したがって、PI3-KもまたPKCの上流で機能しているものと思われた。

図1

図2

　細胞内Ca²⁺濃度の上昇は、細胞内貯蔵部位からの動員と細胞外からの流入の両者によるが、細胞外のCa²⁺を除去した状態でfMLPを添加すると、一過性の細胞内Ca²⁺の上昇のみが観察され、これは細胞内貯蔵部位からの動員と考えられた。このピークが基底状態まで下降した後に細胞外にCa²⁺を添加すると、fMLPによって再び細胞内Ca²⁺の上昇が観察され、これは細胞外からの流入を意味した(図-1)。細胞内cAMP産生を増大させた条件下では、fMLPによる細胞内Ca²⁺の動員は同様に認められたが、細胞外からの流入が強く抑制された(図-1)。一方、PI3-Kの阻害薬は細胞内貯蔵部位からの動員には全く影響を与えず、細胞外からのCa²⁺流入をむしろ増強した。したがって、cAMPは細胞外Ca²⁺の流入を抑制するが、この抑制は必ずしも活性酸素産生の抑制とは関連しないものと思われた。

　細胞外からCa²⁺を除去してfMLPによる細胞外からのCa²⁺流入を抑制しても、細胞内貯蔵部位からの動員による一過性のピークは観察された。このとき、fMLPによる活性酸素産生は細胞外にCa²⁺が存在する時と全く同様であった。この事実は、cAMPによる細胞外Ca²⁺の流入抑制では活性酸素産生の抑制を説明できない、という先の結果を支持している。

　fMLPはホスホリパーゼA2を活性化して細胞膜リン脂質からアラキドン酸の放出を増加させる。この応答は細胞外からのCa²⁺流入の動態と一致した。すなわち、cAMPによって抑制され、細胞外Ca²⁺の除去によっても抑制されたが、PI3-Kの阻害薬は無効であった。この結果はcAMPによるアラキドン酸放出の抑制もまた活性酸素産生の抑制を説明し得ないことを意味した。

　fMLPはPI3-Kを活性化してホスファチジルイノシトール-3,4,5-トリスホスフェート(PIP₃)の生成を増加させた(図-2)。PIP₃産生はIBMX存在下にPGE₁を添加しておくと抑制され、活性酸素産生の抑制とよい相関を示した(図-2)。PI3-K阻害薬による活性酸素産生の抑制を考え合わせると、PI3-KはcAMPによる活性酸素産生抑制の作用点の一つの候補であると考えられた。

　ラット肝遊離細胞においてEGFはPI3-Kを活性化し、細胞内PIP3産生を増加させた(図3)。このPIP₃産生はPI3-Kの特異的な阻害薬で抑制された。

図3

図4

　EGFとグルカゴンで肝細胞を刺激し、細胞の抽出液を抗ホスホチロシン抗体で免疫沈降してPI3-K活性を測定した。EGFにより免疫沈降画分中のPI3-Kは活性化されたが、グルカゴンの単独刺激は無効であった。しかしながら、このグルカゴン刺激によって細胞内cAMPが増大した状態においては、EGFによるPI3-Kの活性化は著しく増強された。この活性化はワートマンニンとEGF受容体チロシンキナーゼ阻害薬のチロホスチンAG1478によって抑制された(図4)。したがって、チロシンキナーゼ型EGF受容体からPI3-Kに至る何らかの蛋白質分子がcAMP依存的にリン酸化され、EGFによるPI3-Kの活性化が増強される経路が推定された。