fMLP受容体とFc-II受容体刺激による相乗的な活性酸素産生

　無傷の分化THP-1細胞において、fMLP受容体刺激に応答した活性酸素産生を検討したところ、Fc-II受容体の刺激共存下に著しく増強されるという興味深い知見が得られた(Fig.1)。尚、当研究室の検討によりCD38分子を介してFc-II受容体を刺激することが知られている、抗CD38モノクローナル抗体HB-7を用いても同様の活性酸素の産生増強が認められた。細菌感染などの炎症部位において、複数の受容体が同時に活性化している可能性を考えると、この現象は情報伝達系の相互作用のみならず、生理的にも意義があると考えられる。活性酸素の産生増強に関与する細胞内因子を検索する目的で、fMLP受容体刺激とHB-7を用いたFc-II受容体刺激による、種々のセカンドメッセンジャーの変化を解析した。その結果、イノシトール3,4,5-三リン酸(IP₃)産生量、アラキドン酸放出、細胞内カルシウム動員についてはfMLP受容体刺激に応答した上昇は認められたものの、Fc-II受容体刺激を共存させることによる効果は認められなかった。一方、イノシトールリン脂質(PI)3-キナーゼの反応生成物であるPI-3,4,5-三リン酸(PIP₃)については、両受容体刺激により産生量が増強されていた(Fig.2)。また、PI3-キナーゼの阻害薬であるワートマンニン処理により活性酸素の産生は顕著に抑制された。これらの結果より、両受容体刺激による活性酸素の産生増強において、PI3-キナーゼが重要な役割を果たしていることが示された。

fig.1 fMLPとFcII受容体刺激による活性酸素産生の増強

　一般的に、二量体型のPI3-キナーゼはチロシンリン酸化蛋白質との結合により活性化されることが知られている。そこで、細胞内蛋白質のチロシンリン酸化と活性酸素産生の増強作用の関係を検討した。その結果、細胞内蛋白質のチロシンリン酸化と活性酸素産生の増強という2つの細胞応答を引き起こすHB-7の濃度はほぼ一致した。また、チロシンリン酸化の阻害薬であるハービマイシンの影響を検討したところ、チロシンリン酸化の低下と活性酸素産生の抑制には良い相関性が認められた。これらの結果より、活性酸素の産生増強はFc-II受容体刺激によるチロシンリン酸化の亢進に依存していることが示された。そこで、Fc-II受容体を介するシグナル伝達経路における、蛋白質のチロシンリン酸化とPI3-キナーゼの関連について検討した

Fig.2 fMLPとFcII受容体刺激(HB-7)によるPIP₃産生量の増加

Fc-II受容体刺激によりチロシンリン酸化されるPI3-キナーゼ結合蛋白質の検討

　PI3-キナーゼはチロシンキナーゼ系の情報伝達に関わる重要な酵素であり、触媒サブユニット(p110)とsrc homology2(SH2)ドメインをもつ調節サブユニット(p85)からなる二量体より構成されており、そのp85を介してチロシンリン酸化蛋白質と直接結合することにより活性化される。このPI3-キナーゼと結合するチロシンリン酸化蛋白質としては、PDGF受容体自身やインスリン受容体でリン酸化されるアダプター蛋白質のinsulin receptor substrateなどがよく知られている。Fc-II受容体の場合は受容体自身にはチロシンキナーゼ活性は無く、antigen receptor activation motifsというコンセンサス配列を介してチロシンキナーゼと会合し、細胞内蛋白質をチロシンリン酸化することが知られているが、二量体型PI3-キナーゼを活性化する際に介在するアダプター蛋白質の実体については不明の点が多い。

　そこで、Fc-II受容体とfMLP受容体刺激を介するPI3-キナーゼの活性化機構を検討するために、刺激した細胞の抽出液をPI3-キナーゼの触媒サブユニットに対する抗体で免疫沈降し、チロシンリン酸化蛋白質を解析した。その結果、Fc-II受容体の架橋刺激に依存して、PI3-キナーゼと共沈してくる120kDa(p120)と100kDa(p100)のチロシンリン酸化蛋白質が認められた(Fig.3)。特異的な抗体を用いた解析から、p120はプロトオンコジーン産物であるp120^c-cblと同定された。一方のp100は、これまでにPI3-キナーゼとの相互作用が報告されている蛋白質に対する抗体とは反応せず、新規のものであると考えられた。PI3-キナーゼとこれらの蛋白質の結合様式について検討を行った結果、PI3-キナーゼとチロシンリン酸化蛋白質の会合に関わるSH2領域と直接結合していることが明らかになった。よって、p120^c-cblとp100は、Fc-II受容体の刺激時にチロシンリン酸化されて、PI3-キナーゼを活性化するアダプター蛋白質であると思われる。

Fig.3 FcII受容体刺激によりチロシンリン酸化されるPI3-キナーゼ結合蛋白質の検出IP:anti PI3-kinase p110 subunit IB:anti-PY

　また、Fc-II受容体の架橋刺激によりチロシンリン酸化されるp100について、その特性を検討したところ、fMLP受容体刺激の共存下において、SDS-PAGE上での移動度が、経時的に高分子量側へ移行するという現象が認められた(Fig.4)。

Fig.4 SDS-PAGE上でのfMLP受容体刺激によるp100の移動度の変化IP:anti PI3-kinase p110 subunit IB:anti-PY

　このfMLP受容体刺激共存下におけるp100の高分子量側へのバンドシフトに関わる化学修飾について検討したところ、セリン/スレオニン残基特異的なホスファターゼであるPP2A処理により低分子量側へ戻ることから、セリン/スレオニンリン酸化が起きていることが示された。このp100のバンドシフトは、受容体とG蛋白質の共役を阻害する百日咳毒素で細胞をあらかじめ処理することにより消失し、fMLPの替わりにプロテインキナーゼCを活性化するホルボールエステルで再現された。これらの知見は、fMLP受容体と共役するG蛋白質がプロテインキナーゼCに類似した何らかのセリン/スレオニンキナーゼを活性化し、チロシンリン酸化されてPI3-キナーゼと結合しているp100のセリン/スレオニン残基をさらにリン酸化することを示している。また、ワートマニン処理を行っても、p100のバンドシフトは影響されないことから、p100のバンドシフトに関わるセリン/スレオニンキナーゼは、PI3-キナーゼの下流に存在するキナーゼカスケードの影響を受けないと考えられる。即ち、p100はFc-II受容体刺激によりチロシンリン酸化されるだけではなく、G蛋白質系のシグナル伝達経路を介してセリン/スレオニンリン酸化されるという、二重の制御を受けるユニークなアダプター蛋白質であることが明らかにされた。

　また、PI3-キナーゼの触媒サブユニットに対する抗体の免疫沈降画分におけるPI3-キナーゼ活性を検討した。尚、ヘテロダイマー型のPI3-キナーゼが、チロシンリン酸化ペプチドとG蛋白質のサブユニットにより相乗的に活性化されるという知見があるため、サブユニットの有無における酵素活性を測定した。その結果、Fc-II受容体刺激により、G蛋白質のサブユニット存在下のPI3-キナーゼ活性は相乗的に上昇した。さらに、両受容体刺激によりチロシンリン酸化のみならずセリン/スレオニンリン酸化したp100と結合しているPI3-キナーゼにおいては、Fc-II受容体刺激単独と比較して、G蛋白質のサブユニットに対する感受性が上昇している傾向が認められた。この知見は、アダプター蛋白質の化学修飾によりPI3-キナーゼ活性が制御されている可能性を示しており、PI3-キナーゼの新たな活性化メカニズムを示唆しているという意味で興味深いと考えられる。