心臓の洞房結節はペースメーカー電位を発生し、心臓における心拍リズムを決定している。洞房結節のペースメーカー細胞においては、特徴的な緩徐脱分極相が心拍数の調節に大きく寄与しており、この相を形成するペースメーカーチャネルとしてI_fチャネルが知られている。I_fチャネルは、主に洞房結節、房室結節とプルキンエ束の伝導系に局在し、過分極電位で活性化しNa⁺とK⁺を細胞内に流入する。I_fチャネルはプロテインキナーゼAなどの機能蛋白を介さず細胞内cAMPで直接的に調節を受けており、アドレナリン受容体刺激で細胞内cAMP量が増加すると、活性化の電位依存性が脱分極側にシフトして電流が増大することが明らかにされている。アドレナリン受容体刺激でI_fチャネル電流が増大して緩徐脱分極を促し、ムスカリン受容体刺激ではI_fチャネル電流が減少して緩徐脱分極を抑えて、心拍数を調節すると考えられている。特に、I_fチャネルはL型Ca²⁺チャネルとムスカリン性K⁺チャネルと比較しアセチルコリンに対する感受性が高いので、アセチルコリンの低濃度、つまり副交感神経の発射が低く抑えられているときの心拍調節は主にI_fチャネルによると考えられている。

　I_fチャネルは、自律神経ホルモンによる心拍数調節に重要な役割を果たすが、いまだクローニングがなされておらず分子構造若しくはcAMP結合部位に関する情報は全くない。また、ムスカリン受容体刺激では、抑制性G蛋白を介してI_fチャネル活性化の電位依存性が過分極側にシフトして電流が抑制されることは知られているが、G蛋白以降の経路は明らかではない。

　さらに、I_fチャネルは細胞内cAMPによる調節とは別に細胞内Ca²⁺による調節も受けている。生理的な濃度の範囲内で細胞内Ca²⁺がI_f電流活性化の電位依存性を脱分極側にシフトすることが知られているが、この細胞内Ca²⁺による制御にCa²⁺結合蛋白が関わっているかどうか明らかではない。

　本研究では、I_fチャネルの細胞内cAMPによる制御機構を明らかにするために、まず洞房結節細胞におけるI_fチャネルのムスカリン性制御機構を検討した。次に、I_fチャネルの細胞内cAMP調節部位を分子構造の点から検討するために、洞房結節細胞内に蛋白分解酵素を投与し、細胞内cAMPによるI_fチャネル調節への効果を調べた。さらに洞房結節細胞において、I_fチャネルの細胞内Ca²⁺による制御機構への他の蛋白の関与を明らかにするために、Ca²⁺結合蛋白の関与を調べた。

　ウサギ洞房結節細胞を用いて、電極内にイオノホアであるnystatinを投与し穿孔パッチ法により膜電流を測定した。ホスホジエステラーゼ(PDE)のムスカリン性I_f電流抑制に対する関与を検討するため、非選択的PDE阻害剤IBMX存在下におけるCChの作用を調べた。ムスカリン受容体アゴニストであるcarbachol(CCh)による洞房結節I_f電流抑制作用がIBMXにより減弱した。よって、PDEは洞房結節ムスカリン受容体刺激によるI_f電流抑制制御経路に関与していることが示された。cGMP依存性PDE阻害剤であるEHNAにより、CChによる洞房結節I_f電流抑制作用が減弱し、洞房結節ムスカリン受容体刺激によるI_f電流抑制制御経路に関与しているPDEはcGMP依存性ホスホジエステラーゼであることが示された。

　ウサギ洞房結節細胞のL型Ca²⁺チャネルにおいてPDE typeIIを活性化する経路としてNO合成系によるcGMP産生が示されているので、CChによる洞房結節I_f電流抑制作用に対するNO合成阻害剤N^G-monomethyl-L-arginine acetate(L-NMMA)の影響を検討した。以前の報告通り、L-NMMAにより、CChによるL型Ca²⁺電流抑制作用は減弱したが、CChによるI_f電流抑制作用は減弱しなかった。よって、I_fチャネルのムスカリン性制御にNO合成系の関与がないことが示された。

　以上の結果より、ウサギ洞房結節細胞におけるI_fチャネルのムスカリン性制御には同細胞内のL型Ca²⁺チャネルと同様にcGMP依存性ホスホジエステラーゼが関与するが、L型Ca²⁺チャネルとは異なり、NO合成系は介さず他の経路を介することを示し、細胞内情報伝達系が局在化している可能性が示された。

図1.CChのI_fチャネルおよびL型Ca²⁺チャネル電流抑制作用に対するPDE阻害剤とNO合成酵素限害剤の作用.A.IBMXのI_fに対する(薬物投与前を100%とした)b.Iso刺激下でのCChによるI_fまたはI_Ca(L)抑制作用に対するEHNAとL-NMMAの効果(Iso刺激下での電流の大きさを100%とした)

　I_fチャネルの細胞内cAMP調節部位を分子構造の点から検討するために、洞房結節細胞内にcarboxypeptidase Aを投与し、細胞内cAMPによるI_fチャネル調節への効果を調べた。洞房結節細胞内に自然拡散によりcarboxypeptidase Aを投与すると、l-isoproterenolとcarbacholによるI_fチャネルの増大と減少の作用が消失した。アドレナリン性受容体とムスカリン性受容体の両方に対する作用が消失したので受容体に対する影響ではないと考え、次に細胞内灌流により直接にcAMPを与えたときの作用を検討した。Carboxypeptidase Aにより細胞内灌流したcAMPに対するL型Ca²⁺電流の感受性が消失したとき、同時に測定したI_f電流の細胞内cAMPに対する感受性も消失した。

　Carboxypeptidase AによりI_f電流が減少した時の過分極刺激による電流活性化の電位依存性を調べた。コントロールに比べて過分極側にシフトする傾向は見られたが、過分極刺激に応じて電流は活性化しチャネル機能自体が酵素で傷害を受けたためにcAMP感受性が消失したのではないことを示した。酵素の投与によりcAMPによる電流活性化の電位依存性の脱分極側へのシフトが消失した。

　以上の結果から、I_fチャネルのカルボキシル末端はチャネル活性化に関わっており、このカルボキシル末端には細胞内cAMP調節部位が存在することが示された。I_fチャネルの機能と分子構造を結びつける初めての知見である。

図2.Iso(1M)とCCh(1M)のI_fに対する作用へのcarboxypeptidase Aの効果.最上段の時間は細胞膜破壊後の時間、つまり細胞内拡散によりcarboxypeptidase Aが投与された時間を示す.点線は電流値が0のレベルを示す.上段、コントロール、下段、carboxypeptidase A.

図3.Carboxypeptidase AのI_fのI-V関係に対する作用.a.コントロール.b.carboxypeptidase A.〇:細胞膜破壊4分後、●:細胞膜破壊23分後、△:cAMP0.2mM.

　ウサギ洞房結節細胞において、I_fチャネルを充分に活性化できる細胞内free-Ca²⁺濃度(100nM)において、カルモジュリンアンタゴニストはI_f電流を抑制した。2種のカルモジュリンアンタゴニストによりI_f電流は抑制されたので、カルモジュリンは細胞内Ca²⁺によるI_fチャネル機能の調節に関わることが示された。

　以上の研究により、自律神経による心拍数調節に主に寄与しているペースメーカーチャネルであるI_fチャネルについて以下のことを示した。1)ムスカリン性制御機構におけるcGMP依存性ホスホジエステラーゼの関与することを示し、L型Ca²⁺チャネルとは異なる局在化した経路をとることを示唆した。2)I_fチャネルの細胞内cAMP結合部位が細胞内カルボキシル末端に存在することを明らかにした。3)I_fチャネルの細胞内Ca²⁺による制御にカルモジュリンが関与することを示した。本研究で得られた知見は、ペースメーカーチャネルであるI_fチャネルの生理学的性質の研究と将来の分子構造解明に多大な貢献をするものであると考えられる。