本研究部塚本らの作製したCEN-ARSプラスミドYCpL2を用いて非相同的組換えに対するsgs1変異の影響について検討した。このプラスミドにはネガティブセレクションマーカーであるCAN1、CYH2遺伝子が乗っており、このプラスミドを保持するcan1 cyh2変異株はカナバニンとシクロヘキシミドに対して感受性を示す。しかし、CAN1、CYH2遺伝子にまたがる欠失変異が起きる事によってプラスミド上のCAN1、CYH2両遺伝子が不活性化されると、カナバニン、シクロヘキシミド両薬剤に対して耐性となりカナバニン、シクロヘキシミドを含有した寒天培地上でコロニーを形成するようになり非相同的組換えが起きたことを検出できる(Figure.1)。この系を用いて組換え頻度を測定した結果sgs1変異株では、約10倍組換え頻度が上昇する事が明らかになった。YCpL2プラスミド上での非相同的組換えの起こる機構については、まずRad52-dependentな相同的組換えによりプラスミドの二量体が形成される。このプラスミドの二量体はCENを二つ持っているため染色体分配の際、娘細胞と母細胞の両方に引っ張られDNAの二重鎖切断が起きる。その後、Hdf1-dependentなEnd-joiningによりプラスミドの組換えが行われると考えられる(Figure.2)。sgs1変異株において観察される非相同的組換えがどの過程に影響を与えているのかを調べるために、sgs1変異株における非相同的組換えのRad52、Hdf1に対する依存性を調べた(Table.1)。その結果、sgs1変異株で上昇した組換え頻度がsgs1 rad52、sgs1 hdf1二重変異株においては大きく減少したので、sgs1変異株において観察される非相同的組換えがRad52、Hdf1に依存する事が明らかとなった。この結果からsgs1変異株において観察される非相同的組換えも上記の機構により起きていると考えられる。またsgs1変異株では相同的組換え頻度が上昇する事、及びsgs1変異がEnd-joining活性に影響を与えない事からsgs1変異は、Rad52-dependentな相同的組換えによりプラスミドの二量体が形成される過程を促進している事が考えられた。

Figure.1 YCpL2の構造

Table 1.sgs1、sgs1 rad52、sgs1 hdf1変異株における非相同的組換え頻度

Figure.3 YCpHRの構造

Figure.2 YCpL2上での欠失変異形成機構

　a.作製したコンストラクション

　今回、我々は相補性試験を行うためにの出芽酵母株を作製した。まず、GAPDHプロモーターにBLM、またはWRNcDNAをプロモーターに対して順向き(sgs1::BLM⁺、sgs1::WRN⁺)もしくは逆向き(sgs1::BLM^-、sgs1::WRN^-)につなぎ、そのDNAフラグメントを野生型出芽酵母株のSGS1遺伝子に挿入した株を作製した。

　b.sgs1変異株が示す"組換え頻度の上昇"の表現型の抑制

　sgs1変異株では、非相同的組換えの頻度が上昇する事は先に述べた。BLM、WRNが、この表現型を相補できるかどうかについてYCpL2プラスミドを用いて実験を試みた。結果は、sgs1::BLM⁺、sgs1::WRN⁺両株共にsgs1変異を部分的に相補する事を明らかにした。さらに、相同的組換えを測定するためにCEN-ARSプラスミドYCpHRを作製した(Figure.3)。このプラスミドはCAN1遺伝子がタンデムに並んだ2つのLEU2遺伝子に挟まれておりLEU2遺伝子間での相同的組換えを検出する系となっている。この系を用いて相同的組換えの頻度を測定したところ、sgs1株では野生株と比較して約8倍相同的組換え頻度が上昇する事が確認された。また、sgs1::BLM⁺、sgs1::WRN⁺両株についてもYCpHRを導入し相同的組換えの頻度を測定したところ、両株共にsgs1株と比較して組換え頻度の低下が認められた。ここで得られた実験結果から相同的組換えに関してBLM、WRNともにsgs1変異を相補する事が明らかとなった。

　c.top3変異株の生育速度の遅延の抑制

　まず、wild type、sgs1、sgs1::BLM⁺、sgs1::BLM^-、sgs1::WRN⁺、sgs1::WRN^-の6つの株についてTOP3遺伝子を破壊した株を作製した。生育速度の測定の結果、top3株とtop3 sgs1::BLM⁺株は生育速度の遅延を示した。この結果はBLMがsgs1変異を抑制している事を示している。しかし、top3 sgs1::WRN⁺株は生育速度の遅延を示さなかったのでWRNはsgs1変異を抑制できない事が分かった。

　d.sgs1変異株におけるHydroxyurea(HU)感受性の抑制

　wild type、sgs1、sgs1::BLM⁺、sgs1::WRN⁺株のそれぞれをほぼ同じ細胞数だけHUの入った寒天培地にスポットすることによりHU存在下での生育の有無を調べた。sgs1、sgs1::WRN⁺株についてはwild typeと比較しHUに対して高い感受性を示した。しかし、sgs1::BLM⁺株については野生株とほぼ同程度の感受性を示したので、BLMはsgs1変異株のHUに対する感受性を相補する事が明らかになった一方、WRNはsgs1変異を相補することができなかった。