有用物質を大量かつ経済的に生産するためのプロセスを開発することは,生物化学工学者の目標の一つである。近年,懸濁細胞を触媒として用いた有用物質の生産が行われている。しかし,この方法では,高い細胞濃度で長時間培養することや,細胞を培養液より効率的に分離し再利用することが困難であるため,生産の経済効率を高めることは難しい。そこで,細胞の固定化技術を用いたプロセスの開発が注目されてきた。しかしながら,現在まで検討されてきた付着性固定化担体は高価なものが多く,また,それらの担体の多くは生分解性を持たないので環境問題を引き起こすことも考えられる。特に,経済改善が必要で豊富な天然資源を有する発展途上国にとっては,簡単かつ経済的に利用できる固定化担体が切望されている。そこで,安価な天然担体であるヘチマ繊維体(loofa sponge)の利用を考えた。

　ヘチマ(Luffa cylindrica)は,熱帯原産で,温帯・熱帯で栽培される蔓生一年草の植物である。果実は円筒形で,自然乾燥により果肉が除かれて細密で多孔性の繊維体だけが残る。この繊維体は,構造の異なる中心部と周縁部から構成され,中心部を囲むように三つの大きな穴がある。繊維体中心部の孔は大きくて構造が荒く,一方,周縁部の孔は小さくて細かい構造になっている(Fig.1)。本研究では,この繊維体を細胞の固定化担体として利用することについて検討を行った。即ち,微生物と植物細胞を用いて,ヘチマ繊維体への固定化特性,固定化方法,最適な固定化条件について検討を行った。また,様々な培養用リアクターを開発し,有用二次代謝物質の生産に利用することを試みた。

Fig.1.Photographs of loofa sponge before immobilization:(a)Front view of the segment of whole sponge(b)Bottom view of the segment of whole sponge(c)Core part(d)peripheral part

　本論文は,全6章で構成されている。第1章では,本論文の背景と目的を述べた。第2章では,ヘチマ繊維体の物性を測定し,従来の付着性固定化担体の物性と比較した。第3章では,微生物である凝集性酵母を用い,ヘチマ繊維体に固定化する方法を確立し,固定化酵母の培養系によるショ糖および廃糖蜜培地からのエタノールの発酵生産を行った。第4章では,ヘチマ繊維体への植物細胞の固定化能力を調べるため,コーヒー細胞をモデルとし,この担体の固定化特性を評価し,最適な固定化条件について検討を行った。また,固定化率の向上と固定化挙動の解明のため,二方向循環型気泡塔リアクターを開発し,固定化の最適条件,固定化された細胞量と細胞活性の分布を明らかにした。第5章では,上述の結果に基づいて,二方向循環型気泡塔リアクターを用い,有用二次代謝物質の生産を試みた。最後に大型の培養リアクターを設計し,コーヒー細胞の繰り返し回分培養を行った。第6章では,本論文を総括した。

　細胞の固定化の難易度および固定化後の生産プロセスの生産性は,固定化担体の物理的な性質と大きな関係がある。そこで,ヘチマ繊維体の様々な物性を検討することを目的とした。

　ヘチマ繊維体の密度,空間率,比空間容積,表面積および繰り返し使用の安定性(固定率,繊維体の重さと容積)を従来の方法に基づいて測定した。

　ヘチマ繊維体と現在用いられている様々な固定化担体との物性を比較したところ,ヘチマ繊維体は最も低い密度を有するだけではなく,繊維体の空間率および比空間容積も非常に大きいことが明らかとなった。従って,ヘチマ繊維体は固定化した細胞を増殖させるための空間を十分に有し,物質移動の点でも有利な担体と考えられた。また,ヘチマ繊維体はpH1.1から14までの幅広いpH安定性を有していた。さらに,繰り返し培養や,オートクレーブの処理によっても,担体の固定能力と性質は変わらなかった。以上,ヘチマ繊維体が充分な耐熱性と耐久性を持っていることを明らかにした。

　ヘチマ繊維体を固定化担体として,凝集性酵母を固定化する方法を確立し,ショ糖および廃糖蜜培地からのエタノールの長期発酵生産を行い,ヘチマ繊維体の担体としての実用性を明らかにすることを目的とした。

　本研究では菌株としてSaccharomyces cerevisiae IR-2を用いた。培養は,2.5Lのジャーファーメンターにヘチマ繊維体を充填し,菌体を固定化した後,繰り返し回分培養および連続培養を行った。

　まず,ヘチマ繊維体に対するS.cerevisiae IR-2の付着性について検討した。20分間で80%以上の菌体がヘチマ繊維体に付着した。0.3(g-cell/g-sponge)の菌体の比率が最適であった。なお,それ以下の濃度で固定化しても24時間以内に菌体はヘチマ繊維体の孔隙で良く増殖し,菌体の固定化量が4.4(g-cell/g-sponge)まで増加した。ショ糖を用い,35回以上の繰り返し回分培養が可能であり,540時間以上の連続培養を行っても安定であった(Fig.2.)。次に,このプロセスを実際の工業生産に応用することを目的として,廃糖蜜を基質としてエタノールの連続生産を行った。その結果,500時間以上の長時間培養を行っても安定であることが確認された。

Fig.2.Continuous ethanol production by Saccharomyces cerevisiae IR-2 immobilized on loofa sponge in a 2.5l jar fermentor. The sucrose concentration in the leed medium was 195 g/l while the dilution rate was 0.07 .

　ヘチマ担体への植物細胞の固定化特性を評価した後,新たなバイオリアクターを開発し,固定化の最適条件と挙動を調べることを目的とした。

　2週間ごとに継代培養したコーヒー細胞を用い,DK培地を含む三角フラスコ,気泡塔リアクターと二方向循環型気泡塔リアクター内に繊維体を設置し(Fig.3.),最適なアグリゲートサイズ,固定化条件と方法を検討した。さらに,同様な培養条件でポリウレタンフォームを用いた結果と比較した。次に,二方向循環型気泡塔リアクターにおいて,ヘチマ繊維体に固定化された細胞の断面分布,軸方向分布とTTC法による呼吸活性を測定した。

Fig.3.Schematic diagrams of flask,bubble column,bubble circular reactor,and bioreactor for the cultivation of immobilized C.arabica cells.

　振盪フラスコを用いてヘチマ担体の固定化能力を測定したところ,固定化に最適なアグリゲートサイズは500m以上であり,繊維体をそのまま使用した場合に,最も高い固定化能力が示された。振盪フラスコでは固定化されにくい小さなアグリゲートを効率的に固定化するため,培地の流動方法の異なる気泡塔を使用した。その結果,アグリゲートサイズの小さいトウキ(Angelica sinensis)でも固定化能力が向上した。ポリウレタンフォームと比較したところ,両者は同程度の固定化能力を示した。

　気泡塔で生じた固定化細胞の不均一分布を解決するため,二方向循環型気泡塔リアクターを開発した。そのリアクター内に設置されたヘチマ繊維体への細胞の最適な固定条件を調べたところ,循環方向を交互に変える方法は,どちらか一方向だけの循環方法より,固定化細胞がヘチマ繊維体に均一に分布し,固定化率も高かった。3日目以降,懸濁細胞はほとんど繊維体に固定化された。最適な通気速度と接種細胞濃度は,39cm/minと0.8g-DCW/Lであった。ヘチマ繊維体の各部位の固定化率を比較した結果,繊維体全体をそのまま使用した場合に細胞が効率よく固定化された。また,固定化された細胞の大部分が繊維体の中心部に付着した。さらに,長時間培養した場合,固定化細胞の分布はより均一になり,1ヶ月後の固定化率は3日間の場合より5倍以上増大した(Fig.4.)。二方向循環型気泡塔リアクターにより固定化された細胞活性は,27日目以降振盪フラスコより高い値を示した。長時間培養した固定化細胞の活性分布を調べたところ,ヘチマ繊維体のような構造をもつポリウレタンフォームよりヘチマ繊維体は高い固定化率と細胞活性を示した。すなわち,ヘチマ繊維体はポリウレタンフォームと同様に優れた固定化担体であることを示した。

Fig.4.Axial Immobillzed cell density distributions of C.arabica cells in loofa sponge after 3,14 and 31 days of incubation in TBC reactor at up/down-flow,39 cm/min aeration rate and 25℃.

　ヘチマ繊維体に固定化した植物細胞を用いたプロセスの実用性を確かめるため,様々な装置を用い,ヘチマ繊維体による有用二次代謝物質の生産を行うことを目的とした。

　コーヒー細胞を用い,フラスコ,二方向循環型気泡塔リアクターと大型バイオリアクター(Fig.3.)を使用し,回分培養と繰り返し回分培養を行った。

　前章までの結果に基づいて二方向循環型気泡塔リアクターと大型バイオリアクターを用い,ヘチマ繊維体に固定化したコーヒー細胞により,繰り返し回分培養でテオブロミンからカフェインへの生物転換を行った。安定で長時間の繰り返し回分培養が可能であった。