脊椎動物の形づくりにおける最大の問題のひとつは背腹軸の決定である。両生類卵では、背腹軸決定には受精卵中に存在すると考えられている背側決定因子(dorsal determinants)が重要な働きをする。これまでの研究によってアフリカツメガエル卵では背側決定因子活性は未受精卵から受精直後の時期では植物極付近に存在し、その後第一卵割の時期には植物半球の予定背側領域に現れることがわかっている。そして背側決定因子によって生じた背側化情報は、その後に起こる中胚葉誘導を代表とする細胞間の相互作用によって背腹軸形成の主役となるべき中軸構造の形成を引き起こすと考えられている。しかしながら背側決定因子は背腹軸の決定において最も重要な最初のシグナルであるにもかかわらずこれまでのところ未だその実体分子は明らかにされておらず、第一卵割周期における背側決定因子の卵内での局在と挙動についても解明されていない。

　そこで本研究ではアフリカツメガエル卵を用いて以下の実験を行い、背側決定因子の第一卵割周期における卵内での局在と挙動や、またその局在変化が背腹軸構造形成に与える影響について調べた。さらにこれらの研究成果をもとにその実体分子の精製を試みた。

　(1)第一卵割周期における背側決定因子の局在とその挙動について

　(2)第一卵割周期における卵の遠心処理による背側決定因子の局在変化が及ぼすその後の背腹軸構造形成への影響とその関連性について

　(3)背側決定因子の実体分子の精製

　脊椎動物の発生の過程における形づくりでの重要な問題に胚軸(背腹軸・頭尾軸・左右軸)をいかにして形成するかがある。そのうちで最も初期におこり、胚軸形成に直接的に関与しているのが背腹軸の決定である。両生類卵では、背腹軸決定には受精卵中に存在すると考えられている背側決定因子が重要な働きをする。これまでの研究によってアフリカツメガエル卵では背側決定因子活性は未受精卵から受精直後の時期では植物極付近に存在し、その後第一卵割の時期には植物半球の予定背側領域に現れることがわかっている。そして背側決定因子によって生じた背側化情報は、その後に起こる中胚葉誘導を代表とする細胞間の相互作用によって背腹軸形成の主役となるべき中軸構造の形成を引き起こすと考えられている。背側決定因子は背側軸誘導活性を有し初期胚の腹側割球に注入されると注入された胚に二次軸を形成する。しかしながら背側決定因子は背腹軸の決定において最も重要な最初のシグナルであるにもかかわらずこれまでのところ未だその実体分子は明らかにされておらず、背側決定因子の卵内での局在と挙動についても解明されていない。

　本論文は2章からなり、第1章ではアフリカツメガエル卵を用いて正常卵における背側決定因子の卵内での局在と挙動や、遠心処理卵における背側決定因子の局在変化が背腹軸構造形成に与える影響について調べた。第2章ではさらにこれらの研究成果をもとに独自に開発した系を用いて背側決定因子の分画について述べられている。

　第1章では今回提出者が独自に開発した卵の一部の細胞質除去実験によって以下のことを明らかにしている。正常卵では背側決定因子は受精直後には卵の植物半球に均一に局在しているのではなく、卵の植物極から約2/3の範囲の植物半球表層中に拡散していることがわかった。受精から第一卵割までを1.0NTとする標準時間を設定したときに0.3NTまでに植物極付近表層中のごく狭い範囲に集中することがわかった。その後、卵の表層と内部細胞質との間に約30°の表層回転と呼ばれるずれが起こり、この時期に背側決定因子は植物半球表層中の側方および予定背側方向へ拡散しながら移動していくことを詳細に解明した。さらに卵への遠心処理実験において、第一細胞周期の早い時期に卵の動物極から植物極方向へ遠心処理を施すことによって、表層回転に影響を与えず背側決定因子の局在を変えることを試みた。その結果この遠心処理卵から肥大した主として脊索や筋肉を中心とした背側軸構造を持つ超背側化胚が発生することを発見した。これまでリチウム処理などの化学処理によってこのような超背側化胚が生じることは知られていたが、このように物理的処理によって超背側化胚を形成できたのははじめての実験である。そこでこの遠心処理卵における背側決定因子の局在と超背側化胚形成について調べた。その結果この現象が受精後間もない時期の卵の動物極から植物極方向への遠心処理によって、もともと植物極表層周辺に存在していた背側決定因子が赤道部域の広い範囲へ移動・拡散することによって超背側化胚を形成していることを明らかにした。これらの実験結果から正常卵では、背側決定因子が第1卵割が始まる前までに赤道部域の一定範囲の領域にまで移動することで、正常な背側軸構造を形成していることを明らかにした。

　第2章では上記の研究成果をもとに、背側決定因子を明らかにするために生化学的手法を用いて分画を行った。材料にアフリカツメガエルの受精卵を用い、背側決定因子が最も密に局在している0.3NT時期の植物極表層細胞質を今回提出者が独自に開発した方法で卵10,000個からサンプリングした。このことによって、これまで長年多くの人達が試みてきたが成功できなかった、背側決定因子が濃縮された状態の表層細胞質のみを集めることが可能になった。その上更にこの表層細胞質に50mM EGTAを加えホモジェナイズすることにより背側決定因子を可溶化することに今回はじめて成功した。そのホモジェネートから得られた超遠心上清をDEAEカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて分画し、16細胞胚の腹側割球へのマイクロインジェクションアッセイによって背側軸誘導活性を検出した。その結果、宿主と同様な二次軸をつくり出せる強力な背側軸誘導活性をもつ分画が再現的に得られた。また現在、背側決定因子の第一候補として考えられている-カテニンに対するウエスタンブロットをこれらの分画に対して行った結果、-カテニンは背側軸誘導活性が検出されなかった分画に検出された。次にこの活性分画に対し逆相カラムを用いたHPLCを行い、更なる活性分画を得た。その結果、逆相カラムHPLCの溶出位置などから背側決定因子は低分子量の分子であることが示唆された。今回の研究によって、背側決定因子が低分子量の可溶性の物質であり、これまで背側決定因子の第一候補であった-カテニンとは異なる物質である可能性を示したことは大きな成果であるといえる。さらに本研究によって背側決定因子の可溶化及び分画方法が確立されたことで、因子の実体同定に向けた今後の研究に大きく貢献できる有用な情報が得られた。尚この論文審査においては、先に提出された論文では内容が3章に分かれていたが、第1章と第2章について本人が主に関与し得られた研究成果のみを統合して第1章とし、第3章を第2章として修正改訂した。このことによって、論文提出者が研究全体の全てにおいて研究の主要部分に寄与し結果を出したものであることを確認した。

　よって本論文は博士(学術)の学位請求論文として合格と認められる。