アルツハイマー病(Alzheimer’s Disease:AD)は、高齢者の痴呆の原因として最も頻度の高い神経変性疾患であり、進行性の記憶障害や痴呆をその主な症状とする。AD脳に特徴的な病理学的変化としては、大脳皮質や海馬における神経細胞の脱落、A42を主成分とする老人斑、神経原繊維変化の出現などが知られている。AD発症の分子メカニズムは今だ不明であるが、AD症例中の約10%には家族性ADが存在し、アルツハイマー病研究のモデルとなっている。早期発症型家族性アルツハイマー病(Early-Onset Familial Alzheimer’s Disease:EOFAD)は多くの家系が第14染色体に連鎖することが知られおり、本研究でもそのポジショナルクローニングを目指して解析を進めたが、1995年に原因遺伝子Presenilin-1(PS-1)がカナダのSt George-Hyslopらのグループにより報告された(1)。本研究ではPS-1の報告を受けて、国内に存在するFAD家系についてPS-1変異の検索を行い、PS-1変異がAD発症に与える分子メカニズムを理解することを目的とした。

　PS-1は467アミノ酸をコードする8回膜貫通型蛋白質で、一部疎水性の領域を持つループが6番目と7番目の膜貫通領域に存在する(Fig.1)。これまでに43種の変異が報告されており、そのほとんどが塩基置換による膜貫通領域内での点突然変異である(2)。本研究においても、7FAD家系(TK-1、TK-2、AH、KF、KT、OS-2、OS-3)に対し、Direct Sequencing法によりPS-1変異の検索を行ったところ、4家系から新たな点突然変異(TK-2;His163Arg、AH;Ala260Val、OS-2;He213Thr、OS-3;Va196Phe)を検出した(3)。この傾向から、PS-1膜貫通領域内に生じた変異は、本来の膜配向性(トポロジー)に影響を与え、PS-1タンパク質の膜での折り畳みや機能に障害をもたらすと推測される。また、TK-1家系では、intron9のacceptor siteにおいてAG→AAへの塩基置換により、exon10欠失型転写産物(exon10)が生じる新しいタイプの変異を発見した(4)。RT-PCRを用いて、exon10flanking領域を増幅したところ、321b.p.の野性型バンドと233b.p.のexon10の欠失を示すバンドを確認した(Fig.2)。このことからTK-1家系において、PS-1はexon10のabnormal splicingにより、291^-319番目のアミノ酸を欠き、さらに290番目のアミノ酸がSer→Cysに置換していることが判明した。PS-1はexon10がコードするループ領域内でproteolysisを受けて、27-28kDaのN末断片と16-17kDaのC末断片に切断される(5)。exon10欠失型PS-1はこの領域を欠失しているため、proteolysisを生じえない。しかしこの断片化がもたらす生理的意味は不明であるため、exon10欠失型PS-1が発症に与える影響は現在の所よく分かっていない。

Figure 1. PS-1蛋白の模式図●は、本研究において発見された点突然変異を示す(OS-3;Val96Phe-TM1、TK-2;His163Arg-TM3、OS-2;lle213Thr-TM4、AH;Ala260Val-TM6)。また、TK-1家系からはHydrophobic(HP)領域をコードするexon10欠失型変異が検出された。PS-1はHP近傍でProteolysisを受ける。

Figure 2.RT-PCRによるexon 10欠失型PS-1の検出

　PS-1変異がFADを発症させるメカニズムはAD研究における最大の懸案であったが、PS-1を過剰発現した培養細胞や、トランスジェニックマウス脳でA42産生の増加が相次いで報告され、これらの結果はAD発症におけるアミロイド説の一般性を追認するものであった。一方、それら動物脳で顕著なアミロイド蓄積がみられるにもかかわらず、神経細胞脱落は確認されていない。したがって、Aの蓄積はADの必要条件ではあっても、神経細胞死を含むAD発症メカニズムを理解する上では十分ではないと推測される。そこで、AD発症のメカニズムを神経細胞死という観点から理解できないかと考えた。FADの原因遺伝子として単離されたPS-2は、PS-1とアミノ酸レベルで67%の高い相同性を示し、PS-2C末断片はFas-ligandによって誘導されるアポトーシスを抑制することが知られている(6)。Fas-ligandはc-Jun N-terminal Kinase(JNK)やp38などのMAPK family pathwayを活性化することから、PS-2はこれらのpathwayに抑制的に働くと推測される。また、AD脳海馬では選択的に神経細胞死が生じているが(7)、JNK3の活性化はAD脳と同様な神経細胞死を海馬に引き起こす(8)。さらに抗JNK3抗体を用いたAD脳海馬の免疫染色では、選択的な神経細胞死とともに、JNK3が減少していた(7)。これらの知見は、JNK pathwayがもたらすアポトーシスにおいてプレセニンが重要な役割を果たしている可能性を示唆していた。それゆえ本研究では、PS-1がJNK pathwayの活性化に及ぼす影響に着目し検討することとした。

　JNK pathwayはCdc42/PAK/MEKK-1/SEK1/JNKのカスケードを形成し、UV、放射線、活性酸素、サイトカインなどによって活性化する。活性化したJNK蛋白は核内に移行した後、c-Junなどの転写因子を介してアポトーシスを制御していると考えられている。カスケード上の各分子には構成的活性型を持つものがあり、Cdc42G12VやMEKKはJNK pathwayを活性化する。そこで、PS-1およびJNK3をコードする発現プラスミドを構築後、JNK pathwayを強く活性化するMEKK発現プラスミドを共にCOS-7細胞中で一過的に発現させた。Western Blot解析によりJNK3とPS-1の発現量を確認したところ、PS-1によるJNK3の発現量への影響は認められなかった(Fig.3A)。さらに、JNK3の活性を測定するため、細胞溶解液から免疫沈降によりJNK3蛋白のみを精製後、その基質であるGST-c-Junと-32PATPをインキュベーションし、リン酸化GST-c-Junの放射活性を測定・定量化した。その結果、野性型PS-1はMEKKによって誘導される本来のJNK3活性を64.0%に減少させ、一方FAD変異型(M146L、exon10)PS-1では、それぞれ79.4%、81.6%に減少させるにとどめていた(Fig.3B)。さらにこれらの結果を confirmするため、GAL4-c-Jun fusion proteinを用いてLuciferase assayを行った。Cdc42G12V発現プラスミドと共にNIH3T3細胞内でPS-1とJNK3を発現させたところ、野性型PS-1はJNK3の本来の活性を31.4%に減少させ、一方FAD変異型PS-1ではそれぞれ43.7%、49.2%に減少させるにとどめていた(Fig.4)。以上の結果から、野性型PS-1はJNKの活性化に抑制的に働くのに対し、FAD変異型PS-1では抑制の度合が減少することが判明した。

Figure3. COS-7細胞におけるPS-1、JNK3の発現とJNK3活性の測定(A)MEKKと共にPS-1、JNK3発現ベクターをCOS-7細胞内で発現し、抗Flag抗体及び抗Myc抗体を用いてWestern解析を行った。(B)COS-7細胞溶解液から抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行い、GST-c-JunによりJNK3の活性を測定した。

Figure 4. NIH3T3細胞におけるLuciferase assayCdc42G12Vと共にPS-1、JNK3発現ベクターをNIH3T3細胞内で発現し、GAL4-c-Junをレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ活性を測定した(n＝3)。測定結果はANOVA解析を行い、エラーバーは標準偏差を示す。

　培養細胞系を用いた本研究では、野性型PS-1はJNK pathwayの活性化を抑制する機能を持ち、FAD変異型PS-1ではJNK pathway活性化の抑制能を欠いていることが明らかになった。JNK pathwayはさまざまな細胞に普遍的に存在してアポトーシスを制御していることから、培養細胞を用いて示された結果は、神経細胞死の過程におけるJNK pathwayのメカニズムを一部反映している可能性がある。JNK pathwayの活性化によって生じるアポトーシスのメカニズムはまだ明らかになっていないため、PS-1がどのようなメカニズムを用いてJNK pathwayの活性化を抑制しているのかは推測の域を出ない。しかし最近の報告では、Cdc42/PAK/MEKK-1/SEK1/JNKのカスケードのさらに下流にはCaspase-3(CPP-32)が存在し、Caspase-3の活性化がポジティブフィードバックループによって上流のMEKK-1を再活性化することが示されている(9)(10)。興味深いことに、PS-1やPS-2はアポトーシス誘導下、上述のproteolysis以外に別のループ領域のAQRDS(342^-346 amino acids)付近でCaspase-3により切断を受けることが明らかとなっている(11)。これらを総合すると、PS-1はJNK pathwayでCaspase-3を介したポジティブフィードバックループに対し、自らがCaspase-3の基質となることで、JNK patwayの再活性化を抑制している可能性が考えられる。言い換えれば、外部環境からのストレスによって生じたアポトーシス実行のシグナルをPS-1は吸収していると考えられる。したがって、培養細胞系での成果をもとに、中枢神経系でのPS-1とJNK pathwayの役割を明らかにすることによって、アルツハイマー病発症メカニズムの解明に大きく貢献することが期待される。