RHC21遺伝子の遺伝子破壊株を作製したところ、遺伝子破壊株が生育できず、細胞の生育に必須であることが分かった。そこで、Plasmid shuffling法によってRHC21遺伝子の温度感受性株を単離し、制限温度における細胞の解析を行った。rhc21変異株は野性株に比べて制限温度でlarge-budの表現型を示す細胞の割合が多くなり、さらにその核構造を調べると、核が細胞のネックの部位に分配が不完全な状態でとどまっている細胞や部分的にのびたスピンドルに染色体が不均一に引き伸ばされる異常な染色体分配の細胞が観察された(Fig.1,2)。

Fig.1 Cell morphology at the restrictive temperature Square,unbudded cell:daiamond,small-budded cell:ciccle,large-budded cell

Fig.2 Percentage of large-budded cells with nuclei of the structures indicated in the positions shown in the schematic drawing

　さらに、rhc21変異株では準許容温度でもミニ染色体の安定性が顕著に低下することからもRHC21遺伝子産物が染色体の分配に働いていることが示された(Fig.3)。FACScanによるDNA合量の解析から、rhc21変異株は制限温度でもDNA合成は正常に起こる示されたので(Fig.4)、RHC21遺伝子は体細胞分裂における正常な染色体の分配に関与することが明らかになった。

Fig.3 Mitotic instability of circular mini-chromosome in the rhc21-sk16 at 25℃ opened circle,RHC21;closed circle,rhc21-sk16

Fig.4 Flow cytrometry analysis of RHC21 and rhc21-sk16 at the restrictive temperature after arrest at Gl phase

　また、rhc21変異株は微小管の重合阻害剤に対して高感受性を示すことから、正常な染色体の分配の機能がチューブリンと何らかの関連があると考えられた。最近、他のグループから、出芽酵母RHC21がS期に複製された姉妹染色分体同士をM期中期までつなぎとめる働きを持つ、いわゆるcohesinの一つであるという報告がなさた。本研究においてRHC21遺伝子産物は正常な染色体分配に必須であることが明らかになったが、このことはRHC21遺伝子産物が姉妹染色分体をつなぎ止め、未成熟な染色体分配を抑えるというcohesinの機能を有することとよく合致しており、cohesinが正常なmitosisの進行に重要な役割を果たすことを示すものである。

　RHC21遺伝子の変異株では、UVや線照射などのDNA損傷に対し感受性を示す(Fig.5)。cohesinとして働くRHC21遺伝子産物がDNA修復にどのように関与するかを明らかにするため、rhc21変異の相同組換えに対する影響を調べた。その結果、rhc21変異株ではの体細胞分裂期における染色体間の相同組換えの頻度が、野生株に比べて頻度が顕著に低下していることが分かった(Fig.6)。したがってrhc21変異株では組換え修復に欠損があるために、DNA損傷に対し感受性を示していることが示唆された。RHC21遺伝子産物の相同組換えへの関与については、RHC21遺伝子産物がcohesinであることを考えると、姉妹染色分体がつなぎ止められた染色体構造が、相同領域の対合をはじめとする相同組換えの諸過程に何らかの形で必要であることが考えられる。また、別の可能性として、RHC21遺伝子産物とともにcohesinとして働くSmc1,Smc3の相同蛋白質が、子牛の胸腺から試験管内での相同組換えを促進する因子として単離されており、RHC21遺伝子産物が直接組換えに関与することが考えられる。

Fig.5 Radiation sensitivity of the rhc21-sk16 mutant at the permissive temperature left,UV;right.-radiation

Fig.6 The frequency of homologous rec-ombination in RHC21 and rhc21-sk16 cicle,RHC21;diamond,rhc21-sk16

　cohesinとしてのRHC21遺伝子の細胞機能の発現とその制御について詳しく調べるために、RHC21遺伝子産物と遺伝的に相互作用する因子を、高発現によってrhc21変異株の温度感受性を抑圧する多コピー抑圧遺伝子(多コピーサブレッサー)として複数単離した(Fig.7)。その一つPDE2はcAMP phosphodiesteraseをコードし、その高発現はPKA経路において、cAMPの濃度を低下させPKAの活性を抑えることが知られている。PKAの制御遺伝子であるBCY1の高発現によってPKAを抑えた場合もrhc21変異株の温度感受性が部分的に抑圧されたことから、RHC21の機能はcAMP/PKA経路によって直接的あるいは間接的に制御されると考えられた。

　また、ZDS1とZDS2の高発現でもrhc21変異株の温度感受性及び異常の染色体の表現型が抑圧することが分かった(Fig.7)。ZDS1、ZDS2はCDC28 protein kinaseを負に制御するSWE1遺伝子の転写を抑圧することが知られており、M期におけるmitotic CDKの活性を上げることによってZDS1あるいはZDS2がrhc21変異株の欠損を抑圧する可能性が考えられた。さらに、G2/M期に欠損があるcdc28-1N変異との二重変異株は合成致死になることが明らかになり、CDC28 protein kinaseはRhc21の機能を間接的あるいは直接的に正に制御していることが示唆された。

　こうして異なるprotein kinaseによりRhc21のcohesinとしての機能が調節を受けていることが示されたが、これはRHC21遺伝子産物が直接リン酸化の基質になって制御を受けている可能性と、例えば他のcohesin complexのcomponentやcohesin機能を調節する他の因子をリン酸化することで間接的に関与している可能性が考えられる。ユビキチンリガーゼであるAPCの活性はPKAによって負に、CDKによって正に制御されることから、二種のprotein kinaseがAPCの活性調節を介して間接的に関与する可能性が考えられた。APCはサイクリンなどの分解を通じて細胞周期の制御に重要な役割を果たすことが知られている。RHC21とAPC/cyclosomeの制御因子であるCDC20の遺伝的相互作用を調べたところ、rhc21変異株の温度感受性がCDC20の高発現によって回復されることが分かった。さらに、cdc20-1変異とrhc21変異の二重変異株は合成致死になること、CDC20によって分解が促進されることでM期後期への進行を可能にするPDS1の高発現によってrhc21変異株の生育が阻害されることも分かった(Fig.8)。以上の結果からRHC21遺伝子は、PKA、CDC28などのリン酸化酵素やAPC/cyclosomeの制御因子であるCDC20と遺伝的相互作用があることが明らかになり、その機能が複雑な制御をうけていることが予想された。

Fig.7 Overexpression of PDE2, ZDS1 or ZDS2 suppresses of temperature sensitivity of rhc21-sk16

Fig.8 Overexpression of PDS1 severe the temperature sensitivity of rhc21-sk16

　体細胞分裂において必須であるRHC21のcohesinとしての機能が、減数分裂においても必要であるかを調べるため、二倍体ホモのrhc21変異株を作製し、解析を行った。その結果、rhc21変異株では胞子形成率が野生株に比べて低下しており(Fig.9)、また生じた胞子の生存率も極めて低いことが分かった(Tab.1)。また、この胞子の生育の低下はRHC21プラスミドによって野生株のレベルまで回復した。したがって、RHC21遺伝子産物は減数分裂でも重要な働きを持っていることが明らかになった。

Fig.9 The effect of rhc21-sk16 mutation on sporulation

Tab.1 Spore viability in RHC21/RHC21 and rhc21/rhc21