RNA結合ドメイン(RNA-binding domain,以下RBDと略記)は,およそ80-90アミノ酸残基にわたるゆるい保存性を持つドメインであり,一般に1本鎖RNAとの結合能を有すると考えられている.現在ではホモロジー検索により,真核生物のおびただしい種類のタンパク質にRBDが存在することが知られており,これらのタンパク質がRNAの転写から翻訳に至る様々な段階でRNA代謝制御系を形成していると推定されている.興味深いことに,RBDを有するタンパク質の多くは,1つのタンパク質分子あたり複数個のRBDを持つ傾向があるが,これまでのところその意義は不明であった.本研究ではRBDの持つこの特徴に着目し,複数個のRBDによる1本鎖RNA認識機構を,NMR法を用いて立体構造の面から解析した.さらにその結果に基づき,RBDがタンパク質1分子あたり複数個見いだされる意義を考察した.

　RBDを持つタンパク質は非常に多くの種類が知られているが,実際に生物学的機能や結合RNA配列が明らかになっている例は少ない.本研究では,機能や結合RNA配列が比較的明らかになっている2種類のタンパク質(Sex-lethal,HuC)に着目し,それらのRBDを解析対象とした.Sex-lethalタンパク質(Sxl)はDrosophilaの性決定に関与するRNA結合タンパク質であり,タンパク質内にタンデムにつながった2つのRBD(Sxl RBD1-RBD2)がtransformer pre-mRNAの3’スプライス部位近傍の配列GUUUUUUUUに結合することにより,選択的スプライシングを制御することが知られている.一方HuCは,高等動物の神経細胞に特異的に見いだされるタンパク質で,3つのRBD(HuC RBD1,RBD2,RBD3)を持ち,うちN末端側のタンデムにつながった2つのRBD(HuC RBD1-RBD2)がmRNAの3’非翻訳領域のAU_3-4配列の繰り返し(AU-rich element,ARE)に結合することでmRNAの寿命を制御することが知られている.これら2つのタンパク質は生物学的機能も結合RNA配列も異なるにも関わらず,Sxl RBD1-RBD2とHuC RBD1-RBD2との間には1次配列に顕著な相同性が認められる.したがって,これら2つを比較することにより,これらに共通のRNA認識機構が明らかになると考えた.

　一般的なRBDには,2つの保存配列RNP1(8アミノ酸残基),RNP2(6アミノ酸残基)があり,一般にこれらがシート面に提示されることでRNA結合を行うと考えられている.ところがSxl RBD2では,RNP1で一般にRNA結合に必要とされる3番目の芳香性残基が保存されず,Val133に置換している(図2).Sxl RBD1の場合はこの配列の保存性がさらに曖昧である.そこでNMR法によりSxl RBD1の立体構造解析を行い,Sxl RBD1上でのRNP1,RNP2に相当する残基を決定した.その結果,Sxl RBD1は一般のRBDと同じフォールディング()をとりながら(図1),シート面上に一般のRBDとは異なる特徴的なアミノ酸配置を持つことが明らかとなった(図2).すなわちSxl RBD1では(1)RNP2上で一般にRNAとの結合に必要とされる2番目の位置の芳香族性残基がIle7に置換され,(2)RNP2上で一般には芳香族性残基の現れない5番目の位置にTyr10が現れ,(3)RNP1上で一般にRNAとの結合に必要とされる塩基性残基がPhe45に置換され,(4)2番目と3番目のシートの間に,他のRBDでは滅多に現れない芳香族性残基が2つ(Tyr39,Tyr43)現れていることが明らかになった.さらに,Sxl RBD1は単独でRNA結合能を持つことより,一般のRBDとは異なるRNA認識機構でRNAを認識すると考えられる.

図1 Sxl RBD1,RBD2およびHuC RBD1,RBD2の立体構造のリボンモデル本研究でNMR法によって決定されたSxl RBD1,HuC RBD1,RBD2,武藤らによって決定されたSxl RBD2の立体構造をリボンモデルで示す.

図2 一般的なRBD,Sxl RBD1,RBD2,およびHuC RBD1,RBD2のシート面のアミノ酸配置RBD上の4本のストランドを矢印で示し,保存配列RNP1,RNP2をで示す.大きい文字は表面を向く残基を示す.丸は疎水性残基,六角形は芳香性残基を表す.白抜は一般的な保存配列から外れた特徴的な残基を表す.これらの残基についてはRBD1-RBD2における残基番号も記した.

3.HuC RBD1,RBD2,RBD1-RBD2のRNA結合能

　2つのRBDがつながることによるRNA結合能への寄与を調べるために,HuC RBD1,RBD2,およびそれらがつながったRBD1-RBD2のRNA結合能を比較した.結合能測定にはNMR法を用い,RNA添加に伴うRBDの¹H,¹⁵Nの化学シフト変化を測定した.その結果,HuC RBD1,RBD2それぞれが単独でRNA結合能を有し,化学シフト変化から推定した結合部位は主にシート面に位置した.ここには,先に述べたHuC RBD1,RBD2上の特徴的なアミノ酸も含まれる.このときの化学シフト変化は,RNAの濃度に依存して徐々に変化する,いわゆる「速い交換速度」の挙動を示したことから,HuC RBD1,RBD2それぞれ単独では短寿命(1 msec以下)の不安定なRBD/RNA複合体を形成することがわかった.

　一方HuC RBD1-RBD2の場合もRBD1,RBD2単独の場合と同様シート面に結合部位を示したが(図3),その化学シフト変化はいわゆる「遅い交換速度」の挙動を示した.これより,HuC RBD1-RBD2/RNA複合体は長寿命(100msec以上)の安定な複合体を形成していることが明らかとなった.このことは,それぞれではRNA結合能が弱いHuC RBD1,RBD2が,2つつながってRBD1-RBD2になることではじめて強い1本鎖RNA結合能を獲得することを示す.

図3 RNA結合に伴うHuC RBD1-RBD2の化学シフト変化RNA UAUUUAUUUUとの結合に伴うRBD1-RBD2上の主鎖のH_N,Nの化学シフト変化を,HuC RBD1,RBD2の立体構造上に示す.

　さらにHuC RBD1-RBD2/RNA複合体では,NOESYスペクトルを測定した.その結果,HuC RBD1-RBD2とRNAとの間に,主にRBD側の疎水性残基に由来する多数の分子間NOEが観測された.この残基のうちのいくつかは,先に述べた特徴的なアミノ酸であるRBD1上のIle7,Leu45,RBD2上のVal133に由来すると推定される.以上述べた特徴はSxl RBD1-RBD2の場合にも見いだされていることから(金,武藤ら;私信),HuC RBD1-RBD2とSxl RBD1-RBD2は,原子レベルで共通のRNA認識機構を持つと考えられる.

　以上の結果に基づき,Sxl RBD1-RBD2,HuC RBD1-RBD2でRBDがつながって存在する意義を考察する.HuC RBD1-RBD2は,それぞれでは結合能の弱いRBD1,RBD2がつながることにより,はじめて強いRNA結合能を示したが,このことは,1個のRBDでは識別できない長い結合RNA配列と特異的に結合する上で合目的である.すなわちRBD1,RBD2の一方がある結合RNA配列の候補と結合したとき,そこが目標のRNA配列でない場合は残りのRBDはRNAと結合することができないため,すばやくRNAから離れて他の結合RNA配列の候補の探索に移行し,その繰り返しにより目的の結合RNA配列にたどり着くことができる.また,今回Sxl RBD1-RBD2とHuC RBD1-RBD2に共通に見いだした特徴的なアミノ酸残基の配置は,RBD1-RBD2が結合RNA配列とより強く結合するために新たに獲得した特徴と推定される.まとめると,タンデムにつながる2つのRBDが1つの機能単位として共進化したことで,より高いRNA結合配列特異性を獲得した,と表現できる.他の複数個のRBDを持つタンパク質でも,高いRNA結合配列特異性を要求される場合には,このような複数のRBD間の共進化が起きていると予想する.