イモリ外胚葉片を高濃度のアクチビンAで処理した場合、YRCが形成される。アクチビン処理片がYRCのみに分化する条件を設定するため、種々の発生段階の胚(後期桑実胚〜初期原腸胚)から切り出した予定外胚葉片に対するアクチビンAの誘導能を単離培養によって調べた。予定外胚葉片は100ng/mlのアクチビンAで1時間処理した後、生理食塩水中で2週間培養して組織分化を検定した。予定外胚葉片の発生段階にかかわらず、処理片中には常にYRCが分化したが、それに伴って低頻度ながら外、中胚葉組織の分化も見られた。しかし初期胞胚の予定外胚葉片を材料に用いた場合には、ほとんどの処理片(95%)がYRCだけで構成されており、外・中胚葉組織が存在しなかった。

　この処理片を他の胚の胞胚腔に移植し、誘導能を調べたところ、中軸中胚葉や神経などをもつ二次軸(胴尾構造)が誘導された。また、TRDA(Texas Red-Dexistran-Amine)でラベルした処理片を用い、移植片の系譜を調べたところ、無処理の外胚葉片は表皮や神経などの外胚葉性の組織に組み込まれたが、アクチビン処理片は中軸中胚葉ではなく宿主胚の内胚葉(主に中腸から後腸領域)のみに組み込まれていた。このことはYRCが内胚葉であることを示唆している。

　以上の結果から、アクチビン処理片は内胚葉に分化するとともに「形成体」として働いて二次軸を誘導することが予想される。正常発生では、形成体(原口上唇部)は背側帯域(dorsal marginal zone;DMZ)より胚の内部に陥入し、体軸を誘導する。胞胚腔への挿入では二次軸を形成する能力を検定することはできても陥入運動を行うか否かは明らかでない。また、正常発生と同様に陥入することが出来れば、より完全な二次軸を誘導できるのではないかと考えた。そこでアクチビン処理片が陥入し、二次軸を誘導する能力をもつかどうかを調るため、VMZへの移植をおこなった。無処理の外胚葉片をを初期原腸胚のVMZに移植すると、移植片は胚表にとどまり、陥入しなかった。それに対し、アクチビン処理片を移植した場合には、移植片は宿主のDMZよりも遅れて少しだけ陥入し、胴尾の特徴をもつ二次軸が誘導された。この場合アクチビン処理片は宿主の陥入よりも遅れたため十分に陥入できず、胴尾構造のみしか誘導できなかったのではないかと考え、より早いステージ(初期胞胚)のVMZに移植した。この場合、移植片は宿主のDMZとほぼ同じタイミングで胚の奥深くまで陥入し、頭部から尾部まで全ての構造を持つ二次軸を誘導した。また、この完全な二次軸が出来たときの移植片の系譜を調べたところ、正常発生におけるDLEの予定運命と同様に咽頭、胃、肝臓などの前腸に分化していた。これらの結果はアクチビン処理片の代わりにDLEを用いた場合とほぼ同様であった。以上より、アクチビン処理したイモリ予定外胚葉片はDLEと同様に、VMZに移植された場合、陥入し、完全な体軸を誘導する形成体としての能力をもつことが示唆された。

　同じ両生類でもイモリとツメガエルの形成体領域(原口上唇部)の構造は大きく異なる。イモリの原口上唇部はほとんど単層からなり、平面的な原基分布である。そして植物極側の内胚葉領域が動物極側の中軸中胚葉を誘導すると考えられている。一方ツメガエルの原口上唇部は多層構造であり、垂直的なな原基分布である。また、外側の内胚葉領域が内側の中軸中胚葉を誘導する能力を持つという報告がある。予定外胚葉領域についても両者の構造は異なっており、イモリが単層であるのに対し、ツメガエルは数層からなる。このためツメガエルにおいて外胚葉片を均一に処理できないことが、外植体全体に内胚葉を誘導する上での障壁になっているのではないかと私は考えた。そこでツメガエル外胚葉片を均一に処理するため、外層と内層をPBS(-)で分離した後、それぞれを高濃度(100ng/ml)のアクチビンで1時間処理し、生理食塩水中で4日間培養して組織分化を検定した。すると、外層と内層を分けなかった処理片は内胚葉細胞の他に外、中胚葉組織が分化したが、外層と内層を分けてそれぞれを処理したものでは外、中胚葉組織を含まない内胚葉細胞塊を高率に形成した。

　この結果はツメガエルにおいても高濃度のアクチビンが内胚葉を誘導することを意味する。そこで次にこの外層と内層を分けたアクチビン処理片を無処理の予定外胚葉片でサンドイッチすることにより、誘導能を調べた。この場合、神経が高率に形成された。特に外層のアクチビン処理片のサンドイッチ外植体は中軸中胚葉も高率に形成した。アクチビン処理片の系譜を調べたところ、内胚葉に分化しており、神経や中軸中胚葉は無処理の外胚葉片の方から形成されていた。

　以上の結果から、アクチビン処理片は内胚葉に分化するとともに神経や中軸中胚葉を誘導することが予想される。そこでアクチビン処理片を胞胚のVMZに移植し、二次軸を誘導する能力を調べた。外層と内層の処理片をそれぞれ単独で胞胚のVMZに移植した場合、胴尾の特徴(中軸中胚葉や神経などを含む)を持つ二次軸が誘導された。それに対して外層と内層の処理片を組み合わせたものを移植した場合、頭部構造を含む二次軸が誘導された。移植片の系譜を調べたところ、アクチビン処理片は神経や中軸中胚葉ではなく主として内胚葉に組み込まれていた。

　これらの結果と類似した現象はツメガエルのDLEについても報告されており、外胚葉片のアクチビン処理により形成される内胚葉とDLEとの類似性がツメガエルにおいても示唆された。