一般にHoxクラスターは構成遺伝子の発現領域に基づき便宜的に前方(anterior;3’末端側),中間(medial),後方(posterior;5’末端側)の3つの領域に分けられる(図1参照)。かつてウニで行われたスクリーニングで前方領域に含まれる遺伝子が検出されなかったことから,体のより頭部側で働くこれらの遺伝子の欠如と,頭部構造を欠く棘皮動物のボディプランの特徴との関連の可能性が指摘されていた。ところが私が以前に行ったヒトデのHox遺伝子探索によって世界で初めてクラスターの最前端(3’末端側)のグループ,PG(パラロガスグループ)1に対応する遺伝子(AM-1)の存在が確認され,棘皮動物のクラスターは,それまで考えられていたよりも一般的なものに近い遺伝子構成を保っていることが示唆された。しかし棘皮動物のHoxクラスターの構成遺伝子についての情報は未だ不完全であった。

　本研究では,現生の棘皮動物の中で最も原始的な体制を保持しているとされるウミユリ類に属する,ニッポンウミシダ(Oxycomanthus japonica)を材料とし,Hox遺伝子の探索とクラスター構造の推定を行った。また,クモヒトデの1種(Stegophiura sladeni)についても同様の探索を行い,その結果も合わせて考察した。

　まず,核DNAからHox遺伝子のホメオボックス領域の一部をPCR法により増幅し,クローン化して塩基配列を決定した。次にこれらの配列と他の動物群も含めた既知のホメオボックス配列との関係を,データベース検索や近隣結合法,最尤法による解析をもとに推定し,ウミシダ,クモヒトデの遺伝子のHoxクラスター上での位置を推定した。そして,以下のような結果を得た。

　(1)ウミシダで11種類,クモヒトデについては9種類のHox遺伝子の存在が確認された。

　(2)それぞれにつき,クラスターの数は,他の調べられている綱(ウニ,ヒトデ)と同じく,ただ1つであることが推定された(図1)。

　(3)ウミシダでは,前方領域に属するPG1,PG2,PG3の全てに対応するものが確認された。棘皮動物の単一の種から前方領域の遺伝子が全て検出されたのは本研究が最初である。

　(4)クラスターの後方領域の遺伝子が従来知られていたよりも多数存在することを示す証拠が得られた。ウミシダからはクラスター後方領域に位置すると思われる遺伝子断片が4種類検出された。その内3つはウニで報告されているもの(Hbox4,Hbox7,Hbox10)に対応し,1つはヒトデで検出されたもの(AM-9)と顕著な相同性が見られた。一方クモヒトデの後方遺伝子については,他の綱のものと対応のつかないもの2種類を含む6種類が検出された。

　これらの結果から棘皮動物の共通祖先の段階に存在したHox遺伝子を推定することが可能となった(図1)。棘皮動物の系統でも,左右相称動物と基本的に同様な1つのクラスターが保持されてきたことが強く示唆される。また,かつて予想されたような,そのボディプラン成立と関わり得るような前方領域の遺伝子の欠失は起こらなかったことが示された。後方領域には少なくとも4種類の遺伝子が存在していたと考えられる。後口動物のHoxクラスターの特徴として後方の遺伝子の重複とアミノ酸配列の大きな変化が知られている。棘皮動物のクラスターも他の後口動物と同様な後方遺伝子の特徴を有していると考えられる。

　このようなことから棘皮動物独自のボディプラン形成にはHoxクラスターの構成要素の数の変化より,むしろHox遺伝子の上下の遺伝子カスケードにおける変化が重要であった可能性が高いといえる。今後各遺伝子の発現パターンの研究が重要な指標となると考えられる。一方で,クモヒトデの結果は棘皮動物の綱のレベルで比較してもクラスター後方の遺伝子が多様化していることが示唆された。このことは棘皮動物間の形態の違いに影響を与えている可能性もあり,今後,各綱のクラスター構造をさらに詳細に調べることで重要な知見が得られることが期待される。

　クラスターの前方領域の遺伝子群は,脊椎動物や節足動物では頭部構造の形成に関与しており,これら左右相称動物と棘皮動物の間の体制の違いが生み出される機構を明らかにする上で特に重要な意味を持つと考えられる。PCR法による探索でその存在が明らかとなったヒトデのHox遺伝子AM-1はクラスター最前端(3’末端側)に位置すると考えられる。この遺伝子の発生過程における発現パターンをチビイトマキヒトデ(Asterina minor)を材料として調べた。

　特異性の高いプローブの作製のためにホメオボックスの外側の配列を得る必要があり,まず幼生の全RNAをもとに合成したcDNAを鋳型としてPCR(3’RACE)を行った。プライマーは,PCR探索で決定された配列をもとに設計した。その結果,ブラキオラリア期後期から変態初期までの幼生より得たcDNAサンプルからAM-1の3’末端側の領域が増幅された。ホメオボックス領域の配列はマウスやショウジョウバエなどのPG1の遺伝子と極めて高い類似性を示す。ホメオボックスの外側の配列に相補的なDIG(digoxigenin)標識プローブを合成し,幼生のホールマウント標本を用いたin situハイブリダイゼーション法によりmRNAを検出した。

　孵化後4-5時間後の幼生の体の後部(盤:将来成体の体の主要な部分が形成される場)に最初のシグナルが検出された。盤での発現はその後変態期を通じて維持された。一方,孵化後約15時間後の幼生で前体腔に発現が確認された。この前体腔での発現のシグナルは,その後変態期に入ると前体腔の先端部付近(ブラキオラリア腕先端付近)に明瞭な局在を示した(図2)。ハイブリダイズ後の標本の切片を作製したところ,発現部位は体腔上皮に限定されていることが確かめられた。盤における発現部位は左右の後体腔と水腔葉の上皮であることがわかった。変態後期から幼若個体にかけて,ブラキオラリア腕の吸収に伴って前体腔でのシグナルは消失し,後体腔における発現は弱まりながらも維持される。

　前体腔の狭い領域に限定された発現パターンは左右相称動物のPG1遺伝子の発現の特徴に対応する。したがって成体の軸性とは異なるにも関わらず,幼生の前後軸に沿って,Hoxシステムが共線形的に働いていることを示唆する。しかし脊索動物では,外胚葉で発現がみられ神経系の分化に重要な役割を担っているのに対し,ヒトデの幼生では発現部位が中胚葉に限定されている。棘皮動物では前後軸に沿った神経系が発達しないこと関係があると思われる。

　一方,盤における発現は棘皮動物に特徴的とみらる。このことはHox遺伝子の発現調節機構の一部に重大な改変が起こっていることを示しており,棘皮動物の形態を特徴づける一因となっていると考えられる。体腔上皮は神経細胞や分泌細胞など様々な種類の細胞を生み出すことから,特定の細胞への分化と関わっていることも考えられる。

　棘皮動物の成体の5本の各腕に沿った軸が他の動物の前後軸に対応するという仮説が出されており,盤におけるHox遺伝子発現はそれを検証するための有効な指標となると考えられる。しかし,AM-1遺伝子の盤のおける発現からは,前体腔でみられた様なPG1遺伝子に特徴的な発現部位の局在は確認できず,腕に沿ったHox遺伝子群の共線形的な発現の有無については不明である。今後,他の遺伝子の発現パターンと合わせて慎重に検討する必要がある。

　このように本論文では,棘皮動物のHox遺伝子クラスターは,予想以上に構造と遺伝子発現パターンの特徴が保存されていることを示した。このことは変態期の大幅な軸性の転換という現象にも関わらず,棘皮動物でもHoxシステムは幼生の前後軸に沿って,左右相称動物同様に機能していることを示唆する。一方,棘皮動物に特徴的な発現パターンが存在することも本研究で明らかにし,成体の特異なボディプラン形成との何らかの関係があることを指摘した。

(図1)推定される棘皮動物Hoxクラスターの遺伝子構成Crinoid:ウミユリ(ウミシダ),Ophiuroid:クモヒトデ(本研究)。Asteroid:ヒトデ(Mito and Endo,1997)。Echinoid:ウニ(Popodi et al.,1996をMartinezとDavidsonとの私信に基づき修正)。Archetypical cluster:棘皮動物の共通祖先のクラスター。右側が3’末端側。数字は脊椎動物のクラスターに基づくPG(パラロガスグループ),Hboxは棘皮動物内のグループの名称を示す。

(図2)ヒトデ幼生におけるAM-1遺伝子の発現部位(変態期のブラキオラリア幼生)グレーの部分が発現のシグナルが観察された領域を示す。矢印は前体腔におけるシグナル局在部位を示す。