天然酵素の中には活性部位に複数種の金属イオンを有するものも多い。そこで異核錯体を用いて、同一錯体上の異なった金属イオンの協同触媒作用を利用する。これは加水分解活性の制御、さらに天然酵素との作用機構の比較という点でも意義深い。

　1、Fe³⁺、Zn²⁺の3つの化学種を組み合わせた反応系でのApA加水分解速度をFigure3に示す。[1]₀に対して[Fe³⁺]₀が1及び2当量の場合はいずれも非常に反応が遅い。Zn²⁺系もまた同様にほとんど活性を持たない。それに対して、[Fe³⁺]₀:[Zn²⁺]₀:[1]₀＝1:1:1の3成分系では効率良く反応が進んでいることが分かる。

Figure3.The rate constants for the hydrolysis of ApA by the combinations of Fe³⁺,Zn²⁺ and 1(＝2.5mM)at pH5.6,50℃.

　加水分解能を有するのは3つの化学種のモル比が1:1:1の場合、即ち異核金属錯体だけであることを強く示唆している。[Fe³⁺]₀:[Zn²⁺]₀:[1]₀＝2:1:1の反応系が加水分解をあまり促進しないのは、Fe³⁺が配位子の配位座を二つとも占拠し、Fe³⁺二核錯体とZn²⁺イオンの形で系内に存在しているため、Fe³⁺とZn²⁺が効率良く協同的に働けないからである。

　さらに[Fe³⁺]₀と[1]₀を一定にし、ApA加水分解反応速度(Figure4a)、及びFe³⁺-フェノレートのMLCT由来の吸収スペクトルの[Zn²⁺]₀依存性を調べた(Figure4b)。

Figure4a.Plot of the rate constant for the ApA hydrolysis by Fe³⁺/Zn²⁺/1 mixtures as a function of [Zn²⁺]₀.Both of[Fe³⁺]₀ and [1]₀ were kept constant at 2.5mM at pH5.6 and 50℃

Figure4b.Electronic absorption spectra for the Fe³⁺/Zn²⁺/1 systems at pH5.5and50℃.Both of[Fe³⁺]₀ and[1]₀ were kept constant at 0.25mM.

　人工リボヌクレアーゼの構築には配位子の設計も重要である。ここでは二核金属錯体の加水分解活性と配位子構造との関連を調べた。

　まず、異なった配位座を導入することによる活性の違いについて検討した。結果、1と2のCu²⁺系でのRNA加水分解活性では非常に大きな差が見られた。[1]₀＝2.5mM、[Cu²⁺]₀＝5mM、pH6、50℃ではApAの半減期はおよそ2時間であり非常に大きな活性を示した。それに対して2は同条件で1の1/10以下の活性しか持たない(Table1)。2よりも電荷的に考えて、基質への結合が弱くなっていると思われるアニオン性の1が大きな活性を持つのは興味深い。1、2は紫外-可視吸収スペクトルから、どちらもモル比1:1、及び2:1でCu²⁺と定量的に単核、及び二核錯体を形成することが確認された。また、Cu²⁺/1系でのApA加水分解速度の配位子濃度依存性では、Cu²⁺との濃度比が[Cu²⁺]₀/[1]₀＝2の時に最も大きな活性を持つ(Figure5)。以上から1のCu²⁺二核錯体が大きな加水分解活性を示していることが解った。しかし、金属イオンをZn²⁺またはCd²⁺にすると、1及び2の金属錯体が有する加水分解活性は完全に逆転する。これらの結果は、金属イオンの選択が配位子の構造と連動して加水分解活性に及ぼしていると考えられる。また、実際に生体内での応用までをも視野に入れると、この様な生体内金属の利用がより好ましい。

Table1.The rate constants(in 10^-4min^-1)for the hydrolysis of ApA by the ligand-metal systems at50℃^*

Figure5.Plot of the rate constant for the ApA hydrolysis vs.[1]₀ at pH6.0 and 50℃.[Cu²⁺]₀ was kept constant at5mM.

　次に配位子構造が及ぼす二核錯体の安定性について調べた。2はLa³⁺の二核錯体を形成し大きなRNA加水分解能を有するものの、その安定度は小さく、[La³⁺]₀/[配位子]₀＝2の水溶液中では全配位子のうち10%程度しか二核として存在しない。対照的に3はカルボキシル基を持つため、より安定化すると考えられる。実際に同条件だと約50%のLa³⁺二核錯体が系内に存在することが¹H-NMRから示された。ApA加水分解活性については、中性条件下、La³⁺イオン単独の4倍を有する(Table2)。

　より効率良くRNAを加水分解する為に有効と考えられる、多核構造を持つ金属クラスターの利用について考察した。

　単独ではあまり加水分解活性のないLa³⁺イオンと、まったく活性のない過酸化水素を組み合わせることで、これらが協同的に働き、RNAの二量体を非常に効率良く加水分解することを見出した。[La³⁺]₀＝10mM、[H₂O₂]₀＝100mMの時、pH7.2、30℃という温和な条件でもApAの半減期はわずか9分であり、無触媒下と比較すると実に5×10⁷倍もの加速効果が認められた。

　これは今までに発見された最も大きな活性をもつ化学種の一つであるTm³⁺イオンに匹敵する。さらにLa³⁺/H₂O₂系でのpH滴定は、eqn.(1)に示すような二核錯体の生成を示唆した(Figure6)。

　この平衡反応は反応条件では大きく生成系に偏っており、遊離のLa³⁺イオンはほとんど無く、ほぼ定量的に[La(OO)₃La]になっている。さらに反応速度はLa³⁺の初期濃度に非常に大きく依存し、各々のlog-logプロットは傾き約3の直線を示した(Figure7)。これらのことから生成した[La(OO)₃La]がさらに相互作用し、eqn.(2)に示すクラスター化した[La(OO)₃La]₃が加水分解活性種であることが分かった。この反応活性種の存在は、ApA加水分解反応の擬一次速度定数と反応溶液のpHとの関係をプロットした実験値と、理論曲線が一致したことからも支持された(Figure8)。

Table2.The pseudo-first-order rate constants for the hydrolysis of ApA by La³⁺/2 or 3 systems at pH7 and 50℃^*

Figure6.Typical titration curve for the La³⁺-H₂O₂ system.The solid line is theoretical and is obtained using the eqn.(1).

　この様に希土類イオンからなる多核クラスターが、RNA加水分解に有効であることを示した。

Figure7.Log-log plot of the pseudo-first-order rate constant vs.[La³⁺]₀ for ApA hydrolysis by La³⁺-H₂O₂ combinations.The solid line is theoretical,in which[La(OO)₃La]₃ is active species.

Figure8.pH-Rate constant profile for the ApA hydrolysis by La³⁺-H₂O₂ combinations.The solid line is theoretical,in which[La(OO)₃La]₃ is active species.