全身免疫系が未発達なマウスにおいても腸管にT細胞マーカーであるCD3のmRNAを発現する細胞が存在するかどうかをCD3に対する半定量的RT-PCRで解析した。胸腺を先天的に欠くヌード(nu/nu)マウスにおいて離乳直後では腸管膜リンパ節細胞にはCD3 mRNAの発現はみられないが、クリプトパッチ細胞およびIELではCD3 mRNAの発現がみられた。このことはIELが胸腺非依存的に分化することを改めて示している。離乳直後のヌードマウスのIELには成熟したIELが多数存在するが、これは腸管以外で胸腺外分化したT細胞が成熟したのち腸管にホーミングしてきた可能性も考えられる。そこでIELの発達分化が腸管局所で起きていることを示すため、次にTCR遺伝子再構成に欠損があるためT細胞分化が途中で停止しているRAG-2欠損(RAG-2^-/-)マウスにおけるCD3 mRNAの発現を調べた。RAG-2^-/-マウスにおいても末梢リンパ組織からの細胞にはCD3 mRNAの発現はみられず、胸腺細胞とIELにだけCD3 mRNAの発現がみられた。さらに、RAG-2^-/-マウスに存在するCD3 mRNA陽性IEL前駆細胞が胸腺由来でないことを証明するため、RAG-2^-/-マウスと同様TCR遺伝子再構成に欠損のあるSCIDマウスに胸腺を欠くnu/nuマウスをかけあわせることにより作製したnu/nuSCIDマウスでもCD3 mRNAの発現を調べた。nu/nuSCIDマウスにおいてもIELにのみ強いCD3 mRNAの発現がみられ、腸管にT前駆細胞が存在することを示した。また、nu/nuSCIDマウスのクリプトパッチにおけるCD3 mRNAの発現はIELと比較し1/100程度であり、クリプトパッチ細胞が未熟なリンパ球であるという免疫組織化学の結果と一致した。これらの結果は腸管局所においてT細胞の発達分化が起きていることを示唆している。

　胸腺におけるTCR T 細胞の発達分化に関しては詳しく調べられている。遺伝子再構成にはRAG(recombination activating gene)-1/RAG-2タンパク質が必要不可欠であり、またTdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)タンパク質は遺伝子再構成時にランダムに塩基を付加しTCR遺伝子に多様性を与えている。TCR遺伝子の再構成はTCR locusに先立ちTCR locusにおいてみらる。TCR遺伝子の再構成を終えた細胞のうちTCR遺伝子のリーディングフレームが適合してプロダクティブな場合のみTCR鎖がpre-T cell receptor (pT)と適切なpre-TCR複合体を形成し、生存シグナルを受けることができるようになる。これらのRAG-2やTdT,pTなどのT前駆細胞に特異的マーカーのmRNAの発現がクリプトパッチ細胞やIELにおいてもみられるかどうかを半定量的RT-PCRで探索した。BALB/cマウスのクリプトパッチ細胞に胸腺細胞よりは弱いものの末梢リンパ節細胞よりは強いTdT,RAG-2,pTのmRNAの発現がみられた。また、IELにおいてもクリプトパッチと同程度のこれらのmRNAの発現が観察された。また、胸腺を欠くnu/nuマウスにおいてもクリプトパッチ細胞およびIELにTdT,RAG-2,pT mRNAの発現がみられた。これらの結果はクリプトパッチにおいてT細胞分化が起きていること、またIELにおいてもこの分化進行中のT前駆細胞が含まれることを示している。

　ある組織の役割を調べるために組織摘除を行いその影響を調べることは有用である。しかしながらクリプトパッチの場合は肉眼では観察不可能な約100mという大きさと、腸管あたり約1,500ヶという膨大な数のため外科的な摘除は不可能である。そこでクリプトパッチを欠失するマウスを検索し、このマウスのIELの性質を明らかにすることによりクリプトパッチの役割を考察した。IL-2R(receptor),IL-4R,IL-7R,IL-9R,IL-15R共通サブユニットであるCR(cytokine receptor )鎖を欠損する(CR^-/Y)マウスではクリプトパッチは見い出せず、CR^-/Yマウスではクリプトパッチを欠失していると結論した。CR^-/Yマウスには胸腺非依存性のCD8⁺-IELや-IEL、あるいはTCR⁺Thy-1^-IELは存在しなかった。一方、少数のCD4⁺-IELやCD8⁺-IELは存在した。このCD4⁺-IELやCD8⁺-IELは胸腺を欠くnu/nuCR^-/Yマウスでは消失しており、これらのサブセットが胸腺依存性であることが示された。nu/nuCR^-/YマウスIELはTCRを発現していなかったが、一部はCD4やB220、CD8、CD8を発現していた。クリプトパッチが存在するnu/+CR^+/Yマウス、nu/nuSCIDマウス、nu/nuマウスのIELはCD8⁺細胞が高割合で存在したが、クリプトパッチが存在しないCR^-/Yマウス、nu/nuCR^-/YマウスのIELではCD8ホモダイマーを発現する細胞はほとんど存在せず、CD8ヘテロダイマーを発現する細胞が少数存在していた。クリプトパッチが存在しないnu/nuCR^-/YマウスのIEL、クリプトパッチが存在するnu/nuSCIDマウスのIELはともにTCRを発現しておらず、同程度の強度のpT mRNAを発現していた。一方、CD3 mRNAの発現は大きく異なりnu/nuSCIDマウスIELはCD3 mRNAを強く発現していたが、nu/nuCR^-/YマウスIELではCD3 mRNAの発現はみられなかった。またnu/nuSCIDマウスIELのほとんどが_E7integrinを発現していたのに対しnu/nuCR^-/Yでは少数が弱く発現しているだけであった。nu/nuCR^-/YマウスのIELはTCR遺伝子再構成がおきていなかった。これらの結果はCD8⁺IELの発達分化にはクリプトパッチは必須の存在であり、CD3 mRNAの発現誘導、_E7integrinの表面発現、TCR遺伝子再構成はクリプトパッチにおいて起きているあるいは運命付けられることを示している。nu/nuCR^-/YマウスのIELはクリプトパッチを通過しないまま小腸上皮間に移動してきたもっとも幼弱なT前駆細胞であると考えられる。

　以上の研究により、IELが腸管局所で発達分化すること、クリプトパッチがIELの発達分化の初期の場であること、そしてクリプトパッチ依存的なIELのサブセットはCD8⁺IELであることが示された。