ブラシノステロイド(BR)は植物界に広く分布し,ナノモル(nmol)レベルの濃度で、細胞伸張、細胞分裂,維管束系の分化、エチレン生合成の促進、ストレス耐性等、様々な生理作用を示す.BR発見後間もない時期から植物ホルモンの一員に加えるべきであるとの声はあったが,BRが植物ホルモンとして広く認められるようになったのはようやく最近のことである.すなわち,BR生合成能欠損突然変異株が発見され,BRが植物の健全な成長に必須であることが明らかになってからである.BR生合成能欠損突然変異体は植物の成長におけるBRの重要性を明らかにしたが,BRの作用は非常に多面的であり,限られた突然変異株の解析だけからでは,その全容を明らかにすることは出来ない.BRの植物の成長調節における機能をより広く追究するにあたっては、任意の時期にBRの生合成を選択的に制御し、BR欠乏状態で発現する形質を解析することが非常に有効であると期待される.このような観点から,新規BR生合成阻害剤の開発を博士論文の研究課題とした.さらに,新規BR生合成阻害剤の開発はBRの機能解明やブラシノライド(BL)と他のホルモンとの相互作用を研究する上で有用であるばかりでなく,BRが関わる遺伝子発現の調節と、それに由来する様々な生体反応や形態形成機構を分子生物学的、生化学的、生理学的な面から追究することを可能にする考えられる.つまり、BR生合成阻害剤の開発は、植物の成長や分化におけるBRの機能や情報伝達経路の解明に役立つばかりでなく,農業生産における新技術の開発など、応用面でも大きな可能性を秘めていると考えられる. ウニコナゾールはGA(ジベレリン)の生合成経路中ent-kaureneからent-kaurenoic acidへの酸化反応を触媒するシトクロムP450酸化酵素を阻害することによりGA生合成阻害活性を示し、植物に対し矮化活性を示す.一方、BR生合成経路でもシトクロムP450が関与すると考えられている酸化反応が多数含まれている.ウニコナゾールはジベレリン生合成におけるカウレンの酸化酵素を特異的に阻害し,BRの生合成には殆ど影響を与えないが,その鏡像体はカウレンの酸化よりもステロイドの酸化をより強く阻害する.そこで,ウニコナゾールの部分構造変換を行うことにより,BR生合成経路で機能するP450酸化酵素に対する特異的阻害剤を創出することが可能であると考え,本研究を展開した.阻害剤開発にあたってはその有効な検定法の確立が必須であることから,生物検定法を確立し、これを用いて選抜を行い,候補化合物の作用特性について詳細な検討を行うこととした.このようにして得られた特異的BR生合成阻害剤を用いて、植物におけるBRの生理機能を追究することにした. 1.新規BR生合成阻害剤の合成 ウニコナゾールの不斉炭素上の置換基の立体配置がシトクロムP450酸化酵素に対する選択性において大きな影響を持つことに着目し、この部位に様々な置換基を導入することによる特異的BR生合成阻害剤の創製を行うことにした.合成中間体3と置換ベンズアルデヒドをmorpholine存在下で縮合させ、カルボニル基を還元して化合物5を得た.また,ウニコナゾールの二重結合が還元された誘導体9は合成中間体3のalikylation,Grignard反応により得られた.化合物9が有する4つの立体異性体のうち1つについてX-線結晶解析により相対立体配置を決定した.活性検定と照合した結果、活性型の化合物は(2S,3R)体あるいは(2R,3S)体であった. 2.生理活性検定系の確立およびBR生合成阻害剤の選抜 合成化合物の生理活性検定はイネ(コシヒカリ)の第2葉鞘伸長抑制試験とシロイヌナズナとクレスの明および暗所での形態変化の観察、胚軸伸長抑制試験を組み合わせて行った.まず,イネ第2葉鞘伸長抑制試験でウニコナゾールに比較して抑制活性が顕著に低下している化合物を選抜することにより、GA生合成阻害活性を殆ど示さない化合物を選抜できた.この中から,シロイヌナズナを用いた検定において、BR生合成能欠損変異株と同様の形態を最も強く誘導する化合物9-1をBR生合成阻害剤の候補として選抜した.化合物9-1で処理したシロイヌナズナは明・暗両所において顕著な矮化現象を示し,GA、サイトカイニン(zeatin)、オーキシン(IAA)等のホルモンを同時に処理しても回復しなかったのに対し,BL処理では回復した.シロイヌナズナを化合物9-1(1M)で処理すると、明所では矮化、葉の暗緑色化、暗所では短く太い胚軸の形成,子葉の展開,葉原基の発達等、BR生合成能欠損突然変異体で観察された特異な形態が認めれた.クレスを用いた検定においても同様の形態変化が観察され、化合物9-1は新規BR生合成阻害剤であると判定した.これにより、上述の複数の検定方法を組みあわせた活性検定によりBR生合成阻害剤を選抜できることも確認された. 3.新規BR生合成阻害剤の作用部位の解明 BRに最も鋭敏な応答を示すイネの第2葉身屈曲試験を用い,BLの生合成中間体と9-1を同時に投与した場合の応答について調べた.この試験において生合成中間体はイネ体内で活性本体であるBLに変換されることにより、活性を示すと考えられている.9-1はCT(cathasterone)の作用を抑制することが確認された.この抑制はBL生合成においてCTより下流に位置するTE(teasterone)に対しては認められないことから,9-1はBR生合成経路中,CTからTEへの側鎖の水酸化過程をブロックすると想定された.シロイヌナズナの胚軸伸長検定系を用いた9-1の阻害部位の追究も行った.明暗両所における9-1処理による矮化状態からのBLおよびBR生合成中間体による回復実験を行った結果,CTやTEは回復作用を示した.したがって,シロイヌナズナでは9-1の作用点はCTの生成より前の段階にあり、BLの生合成経路中,6-oxocampestanolをCTやTEへと変換する側鎖の水酸化過程をブロックすると考えられた.クレスを用いた明所の試験でも9-1誘導の矮性はTEやBLの投与により回復応答を示した.これらの結果から、新規BR生合成阻害剤9-1は、共にシトクロムP450酸化酵素(dwf4,cpd)が触媒するBRの側鎖の2つの水酸化反応をブロックすると考えられた. 4.合成化合物の構造活性相関 各合成化合物の暗所でのシロイヌナズナ下胚軸伸長抑制活性を検定した結果、各化合物は置換基によって著しく異る生理活性を示すことが明かとなった.先ず、合成化合物が選択的なBR生合成阻害活性を有するためにはC2位におけるベンゼン環とメチル基の存在が重要であることが確認した.ベンゼン環がt-ブチル基で置換され化合物の活性は弱いことから、BR生合成阻害活性を有するためには平面構造を有するベンゼン環の存在が重要な役割を果たしていると考えられる.一方、既存のP450阻害剤の報告に基ついて水酸基は活性発現に必須であると予想されていることから、化合物9-1のC2位の水酸基の立体配置も基質特異性を発現するために重要であり、P450酸化酵素の特定部位と相互作用をしていると考えられる.C4位のベンゼン環ではpara位に塩素、臭素、CF3基等の電子吸引基が置換していること必要であり、C4位のベンゼン環のmeta位に塩素、メトキシ等の置換基を導入した化合物は活性が激減することを確認した.明所でクレスを用いた下胚軸伸長抑制試験における構造と活性の相関結果もシロイヌナズナの場合と同様な傾向を示すことを確認した.以上の合成化合物の胚軸伸長抑制活性は処理した化合物の濃度に応じた矮化活性を示すことを確認したことから内生BRの量と胚軸伸長には相関があると考えでいる. 5.新規BR生合成阻害剤の植物に対する効果 新規BR生合成阻害剤を処理することにより誘導される形態は、生合成能欠損変異体に認められる形態と同様であり、植物体内の内生BL濃度が減少したことに起因していると考えることができる.このことは、様々な植物の様々な成長過程においてBR生合成阻害剤を用いることにより誘導される形態的変化を解析することにより、BL自体が本来果たしている役割を明らかにすること、言い換えるならば、BLの生理的意義を詳細に追究することを可能にすると考えられる.そこで、シロイヌナズナ、クレス、キュウリ、トマト、タバコ、エンドウ等の植物に対する新規BR生合成阻害剤の効果を調べることにした.シロイヌナズナに対して阻害剤9-1を処理した結果、暗所では矮化、子葉の展開、葉原基の発達等、光形態形成の誘導が観察された.顕微鏡観察により、阻害剤処理による矮化は細胞の縦軸方向の伸長が抑制されていることが原因であることが示され、BLはGAと共に植物細胞の縦軸方向の伸長誘導に重要な役割を担っていることが明らかとなった.また、シロイヌナズナに暗所で阻害剤9-1を処理した場合、cab,Rubisco,psbA等の光誘導性mRNAの発現量が増加した.シロイヌナズナやクレスを暗所で9-1処理し、引き続き暗所で長期間(30日)生育させた場合、9-1は本葉の発達促進作用を示すことが観察された.阻害剤を処理クレスの場合は明所でも本葉の発達が促進された.このような暗所での光形態形成は阻害剤による内生BL量が減少することにより誘導されるが、他のホルモンの生合成や活性発現、シグナル伝達経路上での相互作用等については未知であり、今後の課題である.シロイヌナズナやクレスで観察されたと同様の現象、すなわち、明所での矮化、葉の暗緑色化、本葉や子葉のカーリング、さらに暗所での胚軸伸長の抑制、子葉の展開等の光形態形成が、阻害剤9-1剤処理したキュウリにおいても観察された.阻害剤9-1処理したトマトやエンドウにおいて誘導された形態変化は、既知のBR生合成酵素欠損株で観察された形態変化と同様であることが確認された.阻害剤処理したタバコにおいても暗所での矮化や子葉の展開、明所での矮化や葉の暗緑色化など共通の現象が観察された. 以上の結果から、新規BR生合成阻害剤9-1の処理による暗所での光形態形成の誘導は双子葉植物一般に観察される現象であろうことが予想されるとともに、BLは植物の成長に本質的な機能を担っていると考えられた. 6.まとめ BRの生理機能を解明するために有用な手段となり得る新規BR生合成阻害剤を創出した.新規阻害剤における立体構造及び置換基はBR生合成系に機能するシトクロムP450酸化酵素に対する特異性を高めるために重要な役割を果たしていることが明らかになった.阻害剤の作用部位はBR生合成経路中の6-oxocampestanolからTEへの側鎖の水酸化反応であることが推定された.阻害剤は内生BR濃度を減少させることによって暗所で胚軸の矮性化、子葉の展開、本葉の発達促進、光誘導性遺伝子の発現増加等の光形態形成に関与していることが示された.新規BR阻害剤を処理することにより現れた形態変化は処理した植物に共通であることから、矮化や暗所での光形態形成は内生BLの量が減少されることにより誘導される普遍的な変化と考えられた. 新規BR生合成阻害剤の利用により植物におけるBRの生理作用や機能を解明するための重要な情報がもたらされることが明かとなった.新規BR生合成阻害剤を用いた研究を展開することにより今後のBLや他のホルモン関連研究分野の進展が期待できると考えている. |