遊離型補酵素NAD(P)⁺、NAD(P)H、ATP等を必要とする酸化還元酵素や合成酵素は酵素全体の約20%を占め、立体特異的合成をはじめ、多くの有用物質生産反応に関与する。これらの酵素をバイオリアクターとして用いるためには、消費された遊離型補酵素を再生しつつ利用することが必要であり、主反応酵素とともに補酵素の再生系を同時に固定化することが必要となる。しかしながら、遊離型補酵素は分子量が小さいためリアクター内に固定化することができず、このため補酵素を高分子化して酵素反応系と共に限外濾過膜リアクター内に固定化し再生しつつ利用する研究例があるものの、高分子化に伴う補酵素の活性、安定性、コスト等の問題がある。本研究では、高分子化しないnative補酵素を用い、これを再生しつつ利用するメンブレンリアクターの開発を試みる。そのために、まず、限外濾過膜(UK-10:分画分子量10,000)、陰荷電性膜NTR-7410、及びナノ濾過膜UTC-20、SSAの各種膜について補酵素に対する阻止率を調べた。その結果、限外濾過膜の補酵素に対する阻止率は0.01であり、NTR-7410の阻止率はイオン強度0では0.85であるものの、この値はイオン強度の増大と共に減少した。これに対してSSAとUTC-20は溶液のイオン強度に関わらず、いずれもNAD、NADP、ATPに対して0.90以上という高い阻止率を示した。そこで、これら二種のナノ濾過膜の水透過係数を測定した結果、UTC-20が高い値を示したため、この膜を用いて平面型ナノ濾過膜リアクター(NFMBR、2ml)を試作した。一方比較対象として限外濾過膜を用いた限外濾過膜反応器(UFMBR)も部分的に使用した。さらに、限外濾過膜として中空糸膜を用いた限外濾過中空糸膜リアクターを必要に応じて使用した。

　試作したUFMBR、NFMBRを用いモデル系として共役酵素系によるNADH再生を伴う2-ケトグルタル酸からL-グルタミン酸の生産を行った。補酵素再生への化学平衡、酵素比活性、酵素コスト、再生用基質コストなどを考慮してグルコース脱水素酵素(GDH)をNADH再生酵素として用いた。120U/mlグルタミン酸脱水素酵素(GluDH)、100 U/ml GDHをUFMBRまたはNFMBRに封入し、0.1M-ケトグルタル酸、0.2MNH₄Cl、グルコース、10^-5MNADを滞留時間80分で供給して連続反応を行ったところ、それぞれの反応転化率は50及び80%、NAD回転数は5,000、8,000、反応器生産性は170、270g/L/Dであった。以上によりGDHはNADH再生用酵素として有用であり、酵素共役系を固定化したメンブレンリアクターによりL-グルタミン酸を生産することができた。また、UFMBRと比較して、NFMBRのほうが反応転化率、NAD回転数及び生産性はいずれも高く、ナノ濾過膜がNADを効率よく部分固定化し、リアクター内に濃縮できることがわかった。一方、UFMBRはNADを物理的に固定化できないが、共役酵素反応の間の動的親和性によりNADが再生され、NFMBRより劣るもののL-グルタミン酸を生産できたことがわかった。さらに、NFMBRにおける反応系に対する酵素濃度、共役酵素間の比率、NAD濃度、基質液平均滞留時間、基質濃度等の影響を検討した結果、L-グルタミン酸への最高反応転化率90%、NAD回転数9,000、反応器生産性119g/L/D、反応器生産半減期125hという良好な結果が得られた。以上の結果は、本プロセスにおいてはNADのコストが1/9,000に低下することを意味している。

　カルニチンはビタミンB_Tとして脂肪酸の代謝に重要な役割を果たしているが、光学異性体の中ではL型のみ生理活性を有し、D体は拮抗阻害特性を示すため、立体特異的合成法が必要とされている。ラセミ体カルニチンの光学分割は容易でなく、そこで、カルニチン脱水素酵素(CDH)を用いることが考えられた。しかしながら、CDHはNADHが必要であり、そこで、NFMBRの適用を試みた。まず11種類のPseudomonas putidaの菌株をスクリーニングし、最も高いCDH活性を有するIAM12014を用い、CDHを粗精製した。基質3-デヒドロカルニチンをpH0.7以下の酸性溶液として他の基質液(トリス緩衝液pH 8)とは別に供給する二流路方式を用い、200 U/mlCDHと200U/mlGDHを固定化したNFMBRに、50mM3-デヒドロカルニチン、0.1Mグルコース、5×10^-5MNADを供給してL-カルニチンを連続生産した結果、反応転化率78%、NAD回転数780、生産性113g/L/D、反応器生産半減期500h以上という良好な値が得られた。

　(R)-3-キヌクリジノールは動脈硬化治療剤等の多種の医薬中間体として用いられている。その立体特異的合成法としてエステル分解酵素によるキヌクリジノールラセミ体エステルの立体選択的加水分解法が考えられるが、不要の(S)活性体を回収するため生産が複雑になりコストも高い。そこで、これを酵素によるキヌクリジノンの不斉還元により生産することを試みた。GDHまたはグルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)それぞれをNADH、NADPH再生用酵素として活性菌体(Rhodotorularubra)と共役させ、NAD、NADPを共存させ、基質としてキヌクリジノン及びグルコース-6-リン酸(G6P)を供給して回分式で生産した結果、それぞれ20、100%の反応転化率を示した。しかしながら菌体のみの系にG6PDHを加えずに基質とNADPのみを供給した結果、100%の反応転化率が得られ、このことより菌体内にNADPH再生系が存在することがわかった。そこで、菌体のみ(4%)をNFMBR内に封入し、50mMキヌクリジノン及びG6P、0.1mMNADPのトリス緩衝液(pH7)を滞留時間160分で供給し、30℃で連続反応した結果、最高反応転化率40%、NAD回転数200、生産性23g/L/Dが得られた。一方、菌体内のNADPH再生系の共役酵素反応の間の動的親和性によりNADPHを再生することも試みた。限外濾過中空糸膜リアクター(UFHR、分画分子量13,000、体積1ml)を用い、菌体(4%)を二重管構造のリアクター内部の中空糸膜内(500l)に固定化し、これに基質液を滞留時間240分で供給し、基質及びNADPを膜外部より拡散輸送して生産した結果、12.5mMのキヌクリジノールが生産速度9.5g/L/Dで得られ、NADP回転数は125であった。

　ATPは生体のエネルギー変換の中で中心的な役割を果たし、ATPを必要とする酵素をバイオリアクターとして用いることができれば様々な合成反応を利用することが可能である。そこで、大腸菌より粗精製したL-グルタミン合成酵素(GS)とATP再生用酵素クレアチンキナーゼ(CK)との共役酵素系よりL-グルタミンの生産にNFMBRの適用を試みた。回分式の結果よりGS/CK反応系にはMg²⁺の添加が必要であった。また、Mg²⁺の添加により、リン酸緩衝液を用いた反応液に沈殿が生じるが、トリス緩衝液には沈殿が生じないことがわかった。2.67U/mlGSと26.7U/mlCKをNFMBRに固定化し、これに50mMクレアチンリン酸及びL-グルタミン酸、30mMMgCl₂、2mMATP、10mMメルカプトエタノール、0.5mMNaN₃のトリス緩衝液(pH7)を滞留時間160分で供給し、30℃で反応させた結果、25mMのL-グルタミンが生産速度33g/L/Dで得られ、ATP回転数は12.5であった。しかしながら、反応の進行につれてリアクター内には沈殿が生じてNFMBRの内圧が上がった。これはGS/CKが反応する際に1分子のリン酸を遊離し、反応液のリン酸濃度が上がり、マグネシウムが沈殿しやすくなったためと考えられる。そこで、UFHRを用いることとした。UFHRは酵素のみを固定化するが、反応液に沈殿が生じても内圧が上がらない特徴がある。UFHR(3ml)にGS(1.25U)およびCK(115U)を中空糸膜内(250l)に固定化し、これに基質液を滞留時間180分で供給した。その結果、45mMのL-グルタミンが生産速度53g/L/Dで得られ、ATP回転数は22.5であった。ATP再生系としてアセトン処理酵母についても検討を加えた。

　以上の結果よりナノ濾過膜UTC-20を用いたNFMBRは遊離型補酵素をリアクター内に部分固定化して、共役酵素により再生利用するバイオリアクターとして有効であることが示された。NFMBRを用いることにより、NAD(P)⁺、NAD(P)H、ATP等を必要とする酵素、微生物菌体等の生体触媒をバイオリアクターとして用いることが広く可能となり、今後これを用いて様々な有用物質生産への応用が期待される。