三浦半島地先で採取したクロアワビ成貝(殻付き重量約350g)を実験に供した。コラーゲンの単離にあたっては、足筋を含む閉殻筋から、0.6M KClおよび0.45M NaClを用いて塩可溶性タンパク質を抽出除去し、さらに、0.1M酢酸を用いて酸可溶性タンパク質を抽出除去した。得られた酸不溶性画分につき、重量比0.1%および1%のペプシンを加えて限定分解し、ペプシン可溶化コラーゲンを調製した。コラーゲン1分子は3本の鎖から構成される。そこで、クロアワビより得られたコラーゲン標品を、SDSゲル電気泳動分析に付したところ、0.1%ペプシン可溶化コラーゲンでは、単一の分子量約10万のコラーゲン鎖が認められた。一方、1%ペプシン可溶化コラーゲンでは分子量10万前後に2種の鎖がみられ、分子量のやや大きい鎖は、0.1%ペプシン可溶化コラーゲンの鎖と同じ移動度を示した。さらに、1%ペプシン可溶化コラーゲンの2種の鎖はそれぞれ異なったN末端アミノ酸配列を示した。なお、0.1%ペプシン可溶化コラーゲン鎖のN末端アミノ酸配列は決定できなかった。

　次に、クロアワビ・コラーゲンの質的な季節変化を検討するため、2月および7月に採取したクロアワビから0.1%ペプシン可溶化コラーゲンを調製し、性状を比較した。アミノ酸組成分析およびペプチドマップ分析を行ったところ、両月のコラーゲン標品の間で大きな違いは認められず、一次構造上の差異は小さいことが示唆された。また、示差走査熱量の測定を行ったところ、2月および7月のコラーゲン標品の熱変性に伴う最大吸熱ピークは、それぞれ34.2℃および35.0℃と、両者の熱安定性に大きな差は認められなかった。

　クロアワビ・コラーゲンの免疫化学的性状を検討するために、0.1%ペプシン可溶化コラーゲンおよびそのゼラチンに対するウサギ抗血清を調製した。これら抗血清の特異性を、0.1%および1%ペプシン可溶化コラーゲンを用いてイムノブロッティング法により調べたところ、抗コラーゲン抗血清は鎖と強く反応したが、筋原線維タンパク質に含まれる他のタンパク質とも反応した。一方、抗ゼラチン抗血清は抗コラーゲン抗血清に比べて鎖に対する抗体価がやや低かった。なお、抗コラーゲン抗血清を用いてイムノブロッティング分析した結果、1%ペプシン可溶化コラーゲンの移動度の大きい鎖に相当するものが、0.1%ペプシン可溶化コラーゲンにも少量存在することが明らかとなった。

　次に、各種脊椎および無脊椎動物のコラーゲン鎖に対する両抗血清の交叉性について検討した。脊椎動物の結合組織中に多量に含まれる線維性のI型コラーゲンは、ほとんどが2種類の鎖から1分子が構成されるが、抗コラーゲン抗血清はウシガエルI型コラーゲンの1および2鎖のいずれともよく反応した。また、コイI型コラーゲンの1鎖とは強く反応したが、2鎖との反応性はみられなかった。さらに、シロザケおよび高等脊椎動物のI型コラーゲンに対する反応性は、2鎖のみにみられた。一方、抗ゼラチン抗血清は、脊椎動物I型コラーゲンの2鎖に対して反応性を示した。しかしながら、両抗血清ともウシIII型およびV型コラーゲンに対しては、交叉性を全く示さなかった。また、各種無脊椎動物から調製したコラーゲンに対する反応性が両抗血清で認められ、とくにサザエ・コラーゲンと強く反応した。

　殻付き重量が約1.4gで孵化後約1年のクロアワビ稚貝の足筋からcDNAライブラリーを作製し、抗クロアワビ・コラーゲン抗血清を用いてライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、プロコラーゲン鎖全長をコードする2種のクローンHdcol(Haliotis discus collagen)1および2を得た。Hdcol 1は全長4,790bp、Hdcol 2は全長4,966bpからなり、それぞれ1,378および1,439アミノ酸残基をコードしていた。両プロコラーゲン鎖とも、線維性コラーゲンに特徴的なドメイン構造を有することを認めたが、演繹アミノ酸配列の間で一致するところは認められなかった。主要部分の三重らせん領域は、両プロコラーゲン鎖ともに1,014アミノ酸残基からなっていたが、トリプレット構造Gly-X-Yに合わないセリンまたはアラニンの存在を1箇所認めた。また、1%ペプシン可溶化コラーゲンで認められた2種の鎖のN末端アミノ酸配列と一致する配列が両クローンのN-テロペプチド領域に存在し、両クローンとも翻訳段階で発現していることが確認された。なお、移動度の大きい鎖はHdcol 1に、移動度の小さい鎖はHdcol 2に対応することが示された。

　次いで、4月の稚貝および成貝を対象に、種々の組織から全RNAを抽出し、ノーザンブロット解析を行った。その結果、稚貝および成貝の筋肉、および成貝の外套膜、肝膵臓で、両クローンとも高いmRNA蓄積量を示した。また、1997年8月から1998年7月まで三浦半島地先で経時的に採取したクロアワビ成貝の閉殻筋、足筋、および肝膵臓につき、ノーザンブロット解析を行った。いずれの組織においても、夏季に採取したクロアワビに比べ、冬季のもので両クローンのmRNA蓄積量が有意に増大することが示され、コラーゲン量の季節変化にコラーゲン生合成系の関与することが示唆された。

　まず、閉殻筋、腸および肝膵臓の粗抽出液および血リンパ液につき、ゼラチン・ザイモグラム法によりゼラチン分解活性を調べた。その結果、各組織のものとも45kDa付近に活性バンドが、また、血リンパ液中にはこのほか、Ca²⁺存在下で活性を示す110kDa成分の存在が示された。また、筋肉抽出液は、37℃、pH4.0および7.5でコラーゲン線維を断片化する活性を示した。この活性は、夏季のクロアワビより冬季の試料でかなり高かった。さらに、pH4.0での反応はシステインプロテアーゼの阻害剤が効果的に作用し、また、pH7.5の反応は金属プロテアーゼの阻害剤による影響を受けた。

　次に、クロアワビよりコラーゲン分解酵素の精製を試みた。まず、閉殻筋から、低イオン強度緩衝液を用いて抽出液を得た。さらに、この抽出液をDEAE-Toyopearl650Mイオン交換カラム、TSK G3000SWG高速ゲルろ過カラム、およびButyl-Toyopearl650M疎水カラムを用いるクロマトグラフィーに供した。なお、コラーゲン分解酵素活性は、クロアワビの0.1%ペプシン可溶化コラーゲンから作製したフィルムの、37℃における分解強度を指標として測定した。活性画分はいずれの精製段階のものとも、37℃,60分以内にコラーゲンフィルムを分解した。最終的に、分子量約148,000の単一のポリペプチド鎖からなる成分を精製した。なお、クロアワビのコラーゲン線維を精製標品と37℃で反応させた後、SDSゲル電気泳動分析に供したところ、コラーゲン鎖の移動度は反応前のものと明確な差を示さなかった。このことから、本酵素はコラーゲン鎖のテロペプチド部分に作用する可能性が示唆された。さらに、活性発現にはCa²⁺やMg²⁺などの2価金属イオンを必要としたが、Zn²⁺の効果は認められなかった。また、N末端アミノ酸配列から新規タンパク質と推定された。しかしながら、本酵素は、夏季と冬季でとくに大きな活性の差を示さなかった。

　以上、本研究により、クロアワビ閉殻筋中に2種のコラーゲン鎖の存在が示された。また、抗クロアワビ・コラーゲン抗血清および抗クロアワビ・ゼラチン抗血清の特異性を明らかにした。さらに、cDNAクローニングにより、2種の鎖の全一次構造を明らかにし、いずれも冬季にmRNA蓄積量が増大することを示した。なお、閉殻筋中のコラーゲン分解酵素の活性には、コラーゲン量の季節変化に対応する変動は認められなかったが、本研究はクロアワビ閉殻筋テクスチャーの季節変化機構の一端を明らかにしたもので、比較生化学および食品化学上に資するところが大きいものと考えられる。