国立環境研究所より分譲を受けたN.minutum(NIES-26)およびN.linckia(NIES-25,28)を10L瓶を用いてCB培地中25℃、明暗サイクル12L:12D、250m・E^-2・s^-1の条件下で通気培養した。得られた凍結乾燥藻体を80%メタノールで抽出し、水とエーテルで二層分配後、水層をさらに水とブタノールで分配した。活性の認められたブタノール画分をODSのフラッシュクロマトグラフィーに付し、メタノールで溶出した活性画分をODSのHPLCにより精製し、N.minutum(NIES-26)よりnostopeptin B(1)、B’(2)およびA’(3)、N.linckia(NIES-25)よりnostopeptin C(4)、D(5)、E(6)、F(7)、G(8)およびH(9)、N.linckia(NIES-28)よりnostopeptin I(10)と命名した新規ペプチドを得ることができた。

　これらペプチドの平面構造は、FABMSおよび各種NMRスペクトルの解析により決定した。通常アミノ酸の立体化学は、酸加水分解物のN-トリフルオロアセチルメチルエステル誘導体のキラルGC分析により、すべてL型であると決定した。N-MeTyrまたN,O-diMeTyrはMarfey法により分析し、L型であった。1〜3のAhpの立体化学は、これらペプチドをNaBH₄を用いて還元し、酸加水分解することによってL-pentahomoserineおよびL-Proが得られたことからAhpの3位はSであると決定し、ROESYスペクトルによって得られたAhpの相対立体化学とあわせて、(3S,6R)であると決定した。4〜10の3-Amino-6-hydroxy-2-piperidone(Ahp)または、3-amino-6-methoxy-2-piperidone(Amp)の立体化学は、これらペプチドをCrO₃を用いて酸化し、酸加水分解することによってL-Gluが得られたことからAhp(or Amp)の3位はSであり、ROESYスペクトルにより得られたAhp(or Amp)の相対立体化学とあわせて、(3S,6R)であると決定した。5-Hydroxy-proline(Hp)および5-methoxy-proline(Mp)についても、同様な方法を用いて、(2S,5R)であると決定した。Nostopeptin C(4)の3-hydroxy-4-methyl-proline(Hmp)の立体化学については、酸加水分解物より単離したHmpをfluorescamineとの縮合体のCDスペクトルおよびUV吸収を測定した。302nmに負のコットン効果、275nmに正のコットン効果が観測され、Hmpの2位の立体はSであると決定した。Nostopeptin G(8)のHmpの立体化学についても、同じくHmpを単離し、そのfluorescamine縮合体のCDスペクトルを測定することにより、2位の立体はSであると決定した。最後に、ROESYスペクトルを測定することにより得られたHmpの相対立体化学とあわせて、Hmpの絶対立体は(2S,3R,4R)であると決定した。他のnostopeptin類のHmpの立体化学は(4)および(8)と各種スペクトルデータの比較することにより決定した。

　Nostopeptin類の6種プロテアーゼに対する阻害活比を、Table I-1にまとめて示した。。Ahpを有するタイプの類縁体1および4〜7は類似した活性でキモトリプシンおよびエラスターゼを強く阻害した。しかし、Hpを有するタイプの類縁体8〜10はIC₅₀＝100g/mLで阻害活性を示さなかった。重DMSO中、温度グランジエントによるアミドプロトンの化学シフトの変化を測定することにより、阻害活性を有する1および4〜7のAhpのアミドプロトンが分子内水素結合に関与していることが確認された。一方、阻害活性がない8〜10には、AhpがHpに置きかわったことでアミドプロトンが消失した。すなわち、水素結合を失ったことで、環構造に変化が生じ、阻害活性が失われたと考えられた。また、2および3の阻害活性が弱いことも、Ahpのアミドプロトンに水素結合が消失することにより、環のコンフォメーションが変化したためと考えられた。

Table I-1.Enzyme inhibitory activities of nostopeptins(IC₅₀＝g/mL)

　藍藻Nostoc minutum(NIES-26)の凍結乾燥藻体を80%メタノールで抽出し、エラスターゼ阻害活性を指標に溶媒分画、ODSのフラッシュクロマトグラフィーおよびHPLCにより活性成分の精製を行い、microviridin G(11)およびH(12)と命名した新規環状ペプチドを得ることができた。

　これらペプチドの平面構造は、アミノ酸分析、FABMSおよび各種NMRスペクトルの解析により決定した。構成アミノ酸の立体化学は、酸加水分解物のN-トリフルオロアセチルメチルエステル誘導体のキラルGC分析によって、すべてL型であると決定した。

　11および12はエラスターゼに対し、それぞれIC₅₀＝0.019および0.031g/mL、キモトリプシンに対し、それぞれIC₅₀＝1.4および2.9g/mLで非常に強い阻害活性を示した。

　藍藻N.minutum(NIES-26)の凍結乾燥藻体を80%メタノールで抽出し、溶媒分画、ODSのフラッシュクロマトグラフィーおよびHPLCにより精製を行い、minutumamide A(13)およびB(14)と命名した新規環状ペプチドを得ることができた。さらに、藍藻N.linckia(NIES-25)より、類似ペプチドminutumamide C(15)およびD(16)を単離・構造決定した。

　これらペプチドの構造は、アミノ酸分析、FABMSおよび各種NMRスペクトルの解析により決定した。いずれも、-アミノ酸4-amino-2-methly-3-oxo-5-phenylvaleric acid(Amopa)を有する環状ペプチドであった。通常アミノ酸の立体化学は、酸加水分解物のN-トリフルオロアセチルイソプロピルエステル誘導体のキラルGC分析によりすべてL型であると決定した。

　13と14の化学シフトを比較したところ、14ではAmopaの位のプロトンの化学シフトが_H3.93で、13では、_H4.80で大きく異なっていた。このことから13と14ではAmopaの位の立体が異なっていると推測された。15と16も同様な化学シフトの差が認められた。

　13および15は、チロシナーゼに対し、IC₅₀＝30g/mLで阻害活性を示したが、14および16は、IC₅₀＝100g/mLで示さなかった。これはAmopaの位の立体違いによるものと考えられた。

　以上、藍藻Nostoc minutum(NIES-26)およびN.linckia(NIES-25,28)より、16種の酵素阻害物質を得ることができ、Nostoc類は酵素阻害物質の探索源として有望であることが示唆された。