太陽光や人工光など波長域の広い光の存在下での植物の蛍光測定は難しい。このことは、研究手法として蛍光測定を利用する際の制限要因となっている。蛍光は、これまでに植物の光合成系の鋭敏な指標となることが示されており、リモートセンシングへの応用に適していると考えられる。従来の蛍光測定の装置では植物への物理的接触があったり、暗処理が必要であったりする上、波長域が広い光の存在下での蛍光測定は困難である。このため、蛍光測定は生産の場で広く用いられていない。

　本研究の目的は、実際の植物生産の場に適応可能な植物の状態診断に蛍光測定を利用する新しい方法を開発することである。この方法では、波長域が広い人工光下での蛍光測定ができ、暗処理や植物への物理的な接触といった植物の活動を阻害するような処理を必要としない。

　最初に、ホウレンソウを用いて予備的実験を行った。主な目的は新しく構築したレーザー励起蛍光(LIF)測定システムの評価である。システムは、アルゴンレーザー、スペクトロメータ、パーソナルコンピュータ、と数種のフィルターおよびレンズから成る。生育ステージが異なる3つの植物群を実験に用いた。クロロフィル蛍光の685nmと740nmにおけるピークの比は、植物群の生育ステージに関連して、齢とともに小さくなった。この実験により、新しいLIFシステムは植物の蛍光が測定できることが示されたが、これは予備実験であり、本研究全体の目的について行われたものではない。

　実験1のシステムでは従来の蛍光測定が可能である。しかし、前述したような本研究の目的を満たすためには新しい方法を開発する必要がある。新しいRelative Referencing Method(RRM)は、連続した光照射下にある植物の蛍光を検知、測定できる。光合成をしている植物からの蛍光シグナルを検出するために、RRMでは、3段階の簡単な方法を用いた。第一段階:はじめに、波長域の広い光照射下にある植物から発せられるエネルギースペクトルを、参照シグナルとして記録する。第二段階:波長域の広い光に加えて、波長域の狭い第二光源からの光を照射する。これら二つの光源から光が照射されたときに植物から発せられたエネルギースペクトルを記録する(Fig.1)。第三段階:第一段階で記録された参照シグナルを第二段階で記録された値から差し引く。このデータを、二つの方法で解析した。一つは、蛍光シグナルの時間変化を観測することによるもので、もうひとつは、平衡状態のシグナルにおける波長の比を計算することによるものである。

　光合成系が制御系のような特性を持つとすると、得られた蛍光シグナルは、ある制御系に段階的入力が起きたときの反応と考えることができる。この段階的な入力によって、第二光源の照射による光エネルギーの段階的な増大がもたらされる。そこで、機械的または電気的な制御系における評価方法を用いて、この系の反応をピークまでの時間、オーバーシュート%および安定までの時間で定量化した。また、これらの方法と同様に、従来の方法もRRMによる蛍光のデータの評価に用いた。

　実験2の目的は、広波長域を持つ人工光を連続照射しているときの植物からの蛍光の検出がRRM法によって可能であることを示し、評価することである。さらに、水ストレスがRRM法により取得したデータにより検出できるかを調べた。RRM法により連続光照射下の植物からの蛍光を検出、計測できた。蛍光データの解析により、RRM法で水ストレスの初期の検出が可能であることが分かった。膨潤時含水量あたりの相対含水量をFig.3に示した。波長R685とR740のキネティック曲線をFig.4に示した。トマト植物に水ストレスが起きるとともに、これらのピークまでの時間は明らかにシフトした。Fig.5から、4日目に、明らかなピークまでの時間のシフトが起きたことが分かる。従来の方法による波長の比、R440/R685、R440/R740、R530/R685およびR530/R740もまた、植物のストレスを反映していたが、これらの明らかな増大が認められたのは相対含水量が70%以下に低下したときであった。この程度の水ストレスを受けた植物は、葉の萎れや縮れ、硬化などの過酷な水ストレスの様相を呈していた。しかし、RRMは実際に植物が栽培されている状態で計測されたものではない。実験2ではサンプルホルダーに垂直に固定された葉について測定を行った。サンプルホルダーの使用は生産の場面では支障がある。

　実験3では、ホルダーを用いずに栽培されている状態のままのトマト植物を実験に供試した。この実験では、RRMは水ストレスの初期の兆候を検出できるかを確認、評価した。7日目における対象区とストレス区との水ポテンシャルの差は0.5MPaであった(Fig.6)。実験2で見られたような、ピークが遅れて現れる現象は実験3では確認できなかった。標準化した波長R685とR740の時間変化を見ると、常に、第二光源からの照射後300-400ms以内に急速なピークが現れた(Fig.7)。従って、この実験ではピークまでの時間と水ポテンシャルの低下との関連は認められなかったが、オーバーシュート%とは関連があった(Fig.8)。また、蛍光強度が定常状態になる前に低下するという通常みられない現象が認められた。このシグナルの振動は一日目から生じていたが、とくに測定最後の二日間のストレス区でもっとも顕著であった。この振動の原因は明らかでないが、従来の解析方法を用いた以前の実験では、光合成によるCO₂同化に合わせて蛍光の二次的な振動が見られた。実験3の結果から、RRM法によって栽培されている状態の植物からの蛍光も検知および測定できることが示された。定常状態における、適当な波長のピークの値を用いてその比率を計算することにより、水ストレスの最初の兆候を検出することができた。

　RRMは植物の蛍光モニタリングの新しい取り組み方法である。波長域が広い光源からの連続光照射下に植物がある状態で、その蛍光のデータを取得することができるこの方法は、生産の場面に応用可能である。RRMは初期の水ストレスを検出できる、非接触および比破壊の計測方法である。しかし、この利便性の高い新しい方法は未だ開発途上であり、より詳細な試験と評価が必要である。

Fig1.Reference and 2nd Source Signal from the plant under ambient FL lighting

Fig2.RRM fluorescence spectrum obtained under FL lighting

Fig3.Transpiration and Relative Water Content(%turgid wt.)(n＝4)

Fig4.R685 Normalized Curves Exp2(n＝12)

Fig5.Time to Peak Exp2(n＝12)

Fig6.Water Potential Exp3(n＝6)

Fig7.R685Normalized Curves Exp3(n＝8)

Fig8.%Overshoot Exp3(n＝8)