P.chrysosporiumをセルロースを炭素源として培養するとき、一般に振とう培養系が利用されるが、振とう下での培養は明らかに天然の状態とかけ離れていると考えられたため、通気静置培養系を使用して培養を行い、菌体外液中の酵素活性を振とう培養系と比較した。その結果、通気静置培養では振とう培養に比べて菌体の成長には差が見られないが、菌体外液中にCDH活性は検出されなかった。光学顕微鏡によって2つの培養系における菌糸の様子を観察したところ、通気静置培養系の菌糸表面にはセルロースの粒子が吸着して菌糸/セルロース複合体を形成しているのに対して、振とう培養系ではそのような複合体は観察されなかった(Fig.2)。この菌糸/セルロース複合体にラミナリナーゼ(-1,3-グルカナーゼ)を作用させると菌糸とセルロースが分離することから、このような複合体形成に菌体外壁であるグルカン層が関与していることが示された。また通気静置培養系から得られた菌体外液と菌糸/セルロース複合体のCDH活性を酸化還元電極によって測定したところ、菌糸/セルロース複合体からは明らかにCDH活性が検出されたことから、通気静置培養系においてもCDHは生産されているが、菌体外液中に遊離してこないことが明らかになった。CDHに特異的に反応する1次抗体と蛍光標識された2次抗体を用いて菌糸/セルロース複合体中のCDHを蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡によって観察したところ、CDHはそのほとんどがセルロース表面に吸着していることが明らかになった(Fig.3)。CDHの吸着は特にセルラーゼの作用によって形成された「ひび割れ」付近に局在していたことから、CDHはセルラーゼと共役してセルロースを分解に関与している可能性が示唆された。

Fig.2 Morphology of the interaction between hypha of P.chrysosporium and cellulose in 10-day-old shake(A)and static(B)cultures.Scale bar indicates100m.

Fig.3 Localization of cellobiose dehydrogenase(CDH)by confocal laser scanning microscopy on in 10-day-old static cultures.H,Hypha;C,cellulose.Scale bar indicates25m.

　CDHの研究を進める上で大量の酵素を生産し、効率良く精製することは非常に重要な行程である。本研究において仔牛血清の培地への添加が、P.chrysosporiumによるCDH生産を著しく増大させる結果が得られたため、仔牛血清添加培養系の最適化を行った。仔牛血清は45ml/L、培養3または4日目に添加した時に最も高いCDH活性が得られ、仔牛血清を添加していない培養系と比較して3.5〜4倍ものCDHが生産された。仔牛血清の培地への添加は-グルコシダーゼの生産も2倍程度増大させたが、他のセルラーゼおよびヘミセルラーゼ活性にはほとんど影響を与えなかった。また、得られた菌体外液から強陰イオン交換、弱陰イオン交換、疎水の3段のカラムクロマトグラフィーによってCDHを分離、精製し、その収率と純度を調べたところ、菌体外液中に生産された活性の75%が精製酵素として回収されており、純度の指標となるRz値(A₄₂₁/A₂₈₀)も0.625と高かったことから、今後の実験では上述の生産および精製法を用いることとした。

　これまでにCDHの存在下でセルラーゼによる結晶性セルロースの分解が促進されるという実験結果が報告されているが、その機構に関しては十分な説明がなされていない。そこで本研究ではP.chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼI(CBHI)によるバクテリアセルロース(BC)およびセロビオースp-ニトロフェノール誘導体(pNPC)の分解に与えるCDH酸化還元系の影響を調べ、セルロース分解過程におけるCDHの機能を考察した。CBHIによるBCの分解はCDHとその電子受容体であるferricyanideの存在下でのみ促進された。その促進機構を解析するためにpNPCを基質として同様の実験を行ったところ、CBHIによるpNPCの分解はBCの時と同程度の促進が観察された。さらにpNPCの系に対して酵素学的パラメータを比較したところ、CDH酸化還元系の存在によってMichaelis定数(Ki)が384Mから142Mに低下しているのに対して、分子活性(k_cat)はどちらの系においても0.025s^-1と全く変化が無いことが明らかになった(Fig.4)。この結果からCDHの酸化還元反応がCBHIの基質に対する親和性を高めていることが示唆された。CBHIはセロビオースによって生成物阻害を受け、その阻害定数(Ki)は65Mであったが、セロビオースをCDHによって酸化したところ阻害が解除されたことから、CDHはCBHIの加水分解生成物を酸化することでCBHIの生成物阻害を解除し、活性を促進していることが示唆された。しかしCDHの生産が確認されていないTri-choderma viride由来のCBHIではCDH酸化還元系による生成物阻害の解除が起こらなかったことから、二つの菌によるセルロース分解機構の違いが示唆された。

Fig.4 Velocity for PhNO₂-cellobiose hydrolysis of by P.chrysosporium CBHI toward substrate concentration with(●)and without(〇)CDH/ferricyanide rdox system.

　CDHはセロビオースやセロオリゴ糖の還元末端を酸化し、その際に様々な電子受容体を利用するが、キノンおよびキノン類似化合物と鉄化合物では反応のpH依存性が異なることが知られている。これにはCDH内の補欠分子族であるフラビンとヘムの間での電子伝達が関与していると考えられている。そこでCDHの補欠分子族であるフラビンとヘムの酸化還元電位のpH依存性を測定し、pH依存性の違いを与える原因を探るとともに、CDHの酸化還元における各反応の電位の比較を行った。P.chrysosporiumの菌体外液から精製されたCDHによるユビキノンおよびチトクロームc還元活性は、pH4.0付近ではほぼ同程度であった。しかし、pH6.0におけるチトクロームc還元活性はpH4.0における活性の4%しかないのに対して、ユビキノン還元活性は65%保たれていた。この現象はpHの上昇に伴うフラビンからヘムへの電子伝達阻害が原因であると考えられているため、CDHにタンパク質分解酵素を作用させてフラビンとヘムを含むドメインを単離し、それぞれの酸化還元電位を測定した。フラビンドメインの電位は酸化還元色素存在下における亜二チオン酸ナトリウムによる還元滴定で行い、ヘムドメインの電位はサイクリックボルタンメトリーによって測定した。さらにこれら補欠分子族の電位のpH依存性を調べたところ、ヘムの電位はフラビンの電位と比較して、測定したpH範囲内のいずれにおいても電子伝達を行うのに十分高いものであり、また、フラビンとヘムの酸化還元電位の差はpHの上昇に伴って大きくなっていた(Fig.5)。この結果から、pH上昇に伴う補欠分子族間の電子伝達阻害は、電位の変化によって起こるのではなく、タンパク質の構造がpHの上昇によって変化することが原因であると考えられた。またCDHの酸化還元系における反応の電位差を比較したところ、生体内酸化還元の終点であると考えられる酸素の水への還元反応における電位とヘムの電位差が著しく大きいことから(Fig.6)、CDH酸化還元系からさらに酸素の還元反応にまで電子伝達を行う酸化還元系が存在する可能性が示唆された。

Fig.5 pH dependence of midpoint potential of flavin(〇)and heme(●)domain.Potentials of flavin domain and heme domain were determined by reductive titration and direct electrochemical technique,respevtively.

Fig.6 Comparison of redox potential of flavin and heme in CDH with cellobiose and molecular oxygen.The potential of cellobiose/cellobionolactone was refered from that of glucose/gluconolactone.

　P.chrysosporiumによるセルロース分解過程においてCDHはセルロース表面の特にセルラーゼが機能している場所にCDHが局在していたことから、CDHがセルラーゼと共役してセルロース分解に関与する可能性が示唆された。

　CDHが生成物(セロビオース)阻害を解除することによって、P.chrysosporium由来のCBHIの活性が促進されていたという結果は、この菌における「CDHとセルラーゼの共役」を裏付けるもので、セルロース分解過程におけるCDH酸化還元系の機能を示唆するものであった。

　CDHの補欠分子族であるフラビンとヘムの酸化還元電位のpH依存性を測定し、電子受容体によって活性のpH依存性が異なるという現象が、電位の変化によるものではないことを示唆した。今回得られたフラビンとヘムの酸化還元電位は、その存在が不明であるCDHの電子受容体の解明、さらにCDH酸化還元系の全容を知るために非常に有益な情報となった。