A.oryzae IAM2608株を可溶性澱粉とペプトンを含むSP培地中で、200lタンクもしくは30lジャーファーメンターを使用して培養し、合計1600lの培養から35kgの菌体を得た。得られた菌体を、ヌクレアーゼOではトルエン存在下30℃で48時間静置し自己消化させた後、ろ液を集め粗酵素液とした。インヒビターの場合は、菌体をホモジナイザーにかけて破砕し、この破砕物を予め加熱しておいた釜に直ちに投入して煮込み、ろ過したろ液を粗酵素液とした。このようにして調製した粗酵素液を硫安沈殿後、各種クロマトグラフィーにより、SDS-PAGE上でそれぞれシングルバンドになるまで精製を行なった。SDS-PAGE上でのヌクレアーゼOおよびそのインヒビターの分子量はそれぞれ30,000と18,000であった。

　精製したヌクレアーゼOのN末端部分とプロテアーゼ分解により得られたペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。それをもとに合成した4種のオリゴヌクレオチドをプローブとして、A.oryzaeの染色体DNAに対するサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果全てのプローブがPstI消化の4.7kbの位量にハイブリダイズすることが認められ、そのバンドをコロニーハイブリダイゼーションによりクローン化した。詳細なサザンハイブリダイゼーションの結果、このDNA断片中のXbaI-SacI約640bp部分に、内部アミノ酸配列から作製したプローブがハイブリダイズすることが確認された。そこで酵素の分子量から推定してHindIII-SalI約2.5kbの間にヌクレアーゼOの全領域が含まれると考えられ、この部分の塩基配列を決定した。塩基配列中には決定した部分アミノ酸配列全てをコードする部分が見いだされたが、1つのreading frame上になく、イントロンの存在が示唆された。そこで、RT-PCRによる増幅及び塩基配列の決定により、イントロンの存在位置4ヶ所を同定した。これらのイントロンには、糸状菌のイントロン中に共通して見いだされる配列が認められた。スプライシング後のヌクレアーゼO遺伝子(nucO)ORFは、990bpからなり、コードする蛋白質の推定分子量35,004は、SDS-PAGE上での精製酵素の分子量約3万とよい一致を示した。また、プロモーター領域にはCAATモチーフとTATAモチーフが存在し、終始コドンの下流域には典型的なpoly A付加シグナルの存在が認められた。

　クローン化したヌクレアーゼO遺伝子を、cotransformation法を用いてA.nidulans FGSC89株に導入し発現させたところ、形質転換体のヌクレアーゼO活性は、ベクターpSal23による形質転換体の活性と比べて最大2.35倍に上昇した。また、この活性はインヒビター蛋白により完全に阻害された。この結果から、クローン化したDNA断片中に実際にヌクレアーゼO遺伝子がコードされていることが確認できた。

　ヌクレアーゼO蛋白が細胞内のどこに局在化しているか調べてみた。A.oryzae IAM2608株をプロトプラスト化したのち破砕し、密度勾配遠心にかけることにより細胞分画を行った。各画分のヌクレアーゼO活性や、精製したヌクレアーゼO蛋白に対して作製した抗体でウェスタンブロットを行った結果、ヌクレアーゼOはミトコンドリア画分に存在することが示唆された。

　ヌクレアーゼOが生育に必須なものであるかどうか調べるために、ヌクレアーゼO遺伝子の破壊株を構築した。構築にはDNA供与体であるIAM2608株が形質転換に使用できる適当なマーカーを持たないため、アルギニン要求性を持つA.oryzae M-2-3株を使用して実験を行った。M-2-3株は高いヌクレアーゼO活性を有しており、しかも染色体DNAに対してnucOをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、IAM2608株と同一の分子量の位置にバンドが1つだけ観察された。よって、M-2-3株にもヌクレアーゼO遺伝子が存在すると判断し、またnucO遺伝子は染色体上に1コピーのみ存在していることが明らかとなった。

　nucO遺伝子のコード領域内のXhoI部位にargB遺伝子を挿入し、nucO遺伝子を破壊したプラスミドを作製した。この断片をM-2-3株に導入し、アルギニン非要求性の形質転換体を選択した。その結果、多数の形質転換体の取得に成功し、得られた形質転換体20株から、サザンハイブリダイゼーションによりnucO遺伝子破壊株を6株取得した。次に、得られた形質転換体のヌクレアーゼO活性とインヒビター活性の測定を行ったところ、形質転換体のヌクレアーゼO活性はほぼなくなっていたが、インヒビター活性は野生株と比べてほとんど差はなかった。更に、形質転換体2株についてミトコンドリア画分を分画した後、ヌクレアーゼOに対する抗体でウエスタンブロッティングを行ったが、形質転換体ではバンドが確認されなかった。このことから形質転換体ではnucO遺伝子が構築通りに破壊されており、ヌクレアーゼO蛋白を生産していないことが判明した。形質転換体が野性株と同様の生育を示すことから、ヌクレアーゼOは細胞に必須のヌクレアーゼではないと判断した。また、自己消化過程と、UVや突然変異誘発物質によるDNA障害の修復機構に対するヌクレアーゼO遺伝子破壊による影響はほとんど見られなかった。

　菌体内ヌクレアーゼについての解析はヌクレアーゼO以外については余り進んでいない、そこでA.oryzaeの菌体内ヌクレアーゼの全体像を明らかにして行くため、新規ヌクレアーゼを精製し、その諸性質の解析を行った。A.oryzae IAM2608をSP培地200lで30℃、30時間攪拌培養し、菌体を集菌した。菌体をホモジナイザーにかけ破砕し、この破砕物を粗酵素液として酵素の精製を行った。精製は硫安沈殿、CM-トヨパール、Mono Sの陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行った。本酵素の分子量はSDS-PAGE上44,000であり、その至適pHは9.0、至適温度は30℃であり、Mg²⁺要求性の酵素であった。また本酵素はDNA,RNA共に作用し、本酵素はヌクレアーゼOに特異的なインヒビター蛋白による阻害を全く受けなかった。この結果から、今回精製した蛋白は新規菌体内ヌクレアーゼであると判断し、ヌクレアーゼQと命名した。

　精製酵素からプロテアーゼ分解により得られたペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。それをもとに合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅断片約260bpをプローブとして、A.oryzaeの染色体DNAに対するサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、プローブがXba I消化の3.5kbの位置にハイブリダイズすることが認められ、そのバンドをコロニーハイブリダイゼーションによりクローン化し、塩基配列を決定した。塩基配列中には決定した部分アミノ酸配列と一致するreading frameが存在し、この部分にヌクレアーゼQ遺伝子が存在することが確認できた。またこの遺伝子中には、1つのイントロンが存在していると推測される。

　本研究ではヌクレアーゼOの遺伝子構造と細胞内の局在性を明らかにした。また、新規菌体内ヌクレアーゼとしてヌクレアーゼQを見出し、その諸性質と遺伝子構造を明らかにした。このようにして得られた知見は、麹菌の菌体内ヌクレアーゼの生理学的役割を解明していくうえで、多いに役立つと考えられる。