これまでにも、哺乳類のカルパインを大腸菌に発現する試みが多くなされてきたが、活性サブユニットのみの発現ではその大半が不溶性画分に回収されてしまい、成功した例はない。しかし、本研究において幾つかの条件を検討した結果、発現プロモーターにlacZを用いること、また発現用の株に大腸菌AD202を用いること、さらに培養温度を32℃に設定することによって活性のあるショウジョウバエカルパインを大腸菌可溶性画分に得ることに成功した。このDm-カルパインの酵素学的諸性質を検討した結果、カルシウム依存性、至適温度、阻害剤の影響、自己消化のいずれの点においても哺乳類のm-カルパインと非常に類似していることを明らかにした。

　哺乳類の組織普遍的カルパインは、活性サブユニットと調節サブユニットからなるヘテロダイマーであるが、Dm-カルパインはゲル濾過クロマトグラフィーの溶出位置から、活性サブユニットのみからなるヘテロダイマーであることが明らかとなった。

<Dm-カルパインの発現及びその酵素学的性質>

　Dm-カルパイン遺伝子からは4つのカルパイン特有の領域を持つ全長のDm-カルパインの他に、第3ドメインの一部と、第4ドメイン(カルシウム結合領域)を持たないスフライス・バリアント(Dm-カルパイン)がつくられる。このような一部の領域を欠いたカルパインは哺乳類においても知られているが、その生化学的諸性質は明らかにされていないので、本研究では上述した発現系を用いてこのDm-カルパインの活性と性質を検討した。このDm-カルパインのショウジョウバエ各世代における発現をRT-PCR法によって検討したところ、Dm-カルパインの1/2〜1/3程度、いずれの世代時期にも発現していることが明らかになった。次に、Dm-カルパインを大腸菌において発現してその活性を調べたところ、第4ドメインを含まないにも関わらずカルシウム依存的なプロテアーゼ活性を示した。これは触媒ドメインのC末端側に存在する1個のEFバンド構造によりカルシウム依存性が生じたものと考えられた。カルシウム要求性はKa＝1.5mMとDm-カルパインよりも若干低い値を示した。また、Dm-カルパインをゲル濾過クロマトグラフィーにより分離すると、モノマーと思われる位置に溶出されたことから、Dm-カルパインは、Dm-カルパインがホモ2量体として存在するのに対し、モノマーとして存在することが予想された。

　ショウジョウバエの卵巣においてDm-カルパインは卵細胞、保育細胞及び濾法細胞の細胞質と細胞膜直下に一様に存在することが抗体染色法により明らかとなった。そこで次に、ショウジョウバエの卵巣におけるDm-カルパインの基質の検索を試みた。卵巣の塩抽出画分をDm-カルパインで消化したところ、幾つかのバンドがカルシウム依存的に消失することが明らかとなった。消失したバンドに相当するものをリシルエンドペプチターゼにより消化し、逆相クロマトグラフィーによって分離した後、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、蛋白質合成関連因子であるEF-1、リボゾーム蛋白質のL6,L7,L8サブユニットなどがDm-カルパインの基質となることが明らかとなった。そのうちの1つEF-1は蛋白質伸長の調節機能の他に、細胞骨格蛋白質であるアクチンやミオシンと相互作用し、それらを切断する活性があることが近年明らかとなり、注目されている。そこでEF-1に関してはGST融合体として発現させ、これをDm-カルパインによって消化したときの分解様式を検討した。その結果、Dm-カルパインはEF-1を数カ所で限定分解することが示され、その分解様式は哺乳類のカルパインによる限定分解と相同であることが明らかとなった。以上の結果から、Dm-カルパインは一次構造上のみならず、生化学的な性質や基質に対する作用という点においても哺乳類の組織普遍的カルパインに非常に近い分子であると結論された。

　これまでにDm-カルパインはショウジョウバエの胚発生の過程においてアクチン細胞骨格に沿った形で局在し、その再編成に関与していることが示唆されている。そこで各種の細胞骨格関連タンパク質が基質となるか否かを上述した発現系を用いて検索した結果、幾つかの細胞骨格調節タンパク質が基質となることが明らかとなった。その一つ、ゲルゾリンは約140アミノ酸残基の繰り返しユニット6個からなるが、Dm-カルパインはその分子のほぼ中央を一カ所切断し、3個ずつの繰り返しユニットを含む2つの断片を生じさせた。Dm-カルパインによるゲルゾリン切断断片のアクチンに対する機能を調べたところ、2つの断片は共にアクチン結合活性を有するが、カルシウム感受性などの性質が異なる機能ドメインに対応していた。次に、ゲルゾリンの切断点近傍のアミノ酸を置換することによってDm-カルパインによる切断が起こらない変異体ゲルゾリンを作製した。この変異ゲルゾリンはアクチンに対する作用は野生型と変わらないが、Dm-カルパインによる切断感受性のみが低下していた。