真正細菌の主要シグマ因子間で保存性の高い領域に対応する合成DNAプライマーを用いて、C.caldariumのtotal DNAより、DNA増幅断片を得た。その塩基配列を検討した結果、真正細菌のシグマ因子において最も強く保存される"rpoD box"をコードする塩基配列が見い出されたため、rpoD boxに対応する合成DNAプローブ(rpoDプローブ)を用いてC.caldariumのtotal DNAに対してサザン解析を行なった。その結果、3種のシグナルが検出されたが、本研究ではその中の2種のDNA領域の解析を行なった。所属の研究室グループの解析結果と併せ、3種のDNA領域はシグマ因子相同遺伝子をコードすることが明らかになったため、それぞれの遺伝子をsigA、sigB、sigCと命名した。sigBとsigCは、極めて相同性が高く、アミノ酸レベルで97.4%という相同性を示した。これらの遺伝子は、分離精製した核及び葉緑体DNAを用いたサザン解析により、核にコードされていることが証明された。

　塩基配列から予想されるsigB、sigC遺伝子産物をそれぞれ、大腸菌内で大量発現させた。これらは封入体として回収されたが、サルコシルにより可溶化され、陰イオン交換カラムで精製した。得られたSigB、SigCタンパク質を大腸菌RNAポリメラーゼのコア酵素と再構成し、大腸菌のコンセンサスプロモーターtac及びRNA Iを持つプラスミドを鋳型にして、in vitro転写実験を行なった。その結果、既に結果が示されていたSigAと同様、SigB、SigCを用いてもこれらのプロモーターからの転写が認められたため、これら3種のタンパク質は、大腸菌主要シグマ因子(⁷⁰)と類似したプロモーター認識特異性を有するシグマ因子であることが示された。また、SigAは葉緑体内に局在することが示されていたため、SigB、SigCもその相同性から、葉緑体内に局在すると考えられ、これらが葉緑体シグマ因子として機能することが示唆された。

　C.caldariumを12時間/12時間の明暗周期で3日間培養した後、4日目に、6時間おきに細胞をサンプリングし、それぞれからtotal RNAを回収した。それらのRNAに対し、sigA及びsigB DNA断片をプローブに用いて、ノーザン解析を行なった。sigBとsigCの極めて高い相同性から、sigBプローブはsigCのmRNAも検出すると考えられる。その結果、sigAでは、明条件下では2種、暗条件下では1種の転写産物が検出されたが、それらの合計量は光条件によらずほぼ一定であった。これに対し、sigB/sigCのmRNAは、主に明条件下で検出され、葉緑体内の光誘導性の遺伝子発現との関連が示唆された。

　本研究の前半では、原始紅藻Cyanidium caldarium strain RK-1を用いて解析を行なった。しかし、シグマ因子によるプラスチド分化制御は高等植物において特に顕著であると考えられることから、次に、植物材料として操作の容易なタバコを用いた解析を行なった。既に単離されていたシロイヌナズナのプラスチドシグマ因子をコードする3種のcDNAをプローブとして、タバコのcDNAライブラリーを検索した。その結果、SigAのホモログをコードする2種のcDNAが得られたため、それらに対応する遺伝子をそれぞれsigA1、sigA2と命名した。sigA2のcDNAについては、5’側の部分が欠けていたため、5’-RACEによって全長の塩基配列を決定した。サザン解析の結果からも、タバコにはSigA相同遺伝子が2種存在することが示唆された。現在では、シロイヌナズナ、イネ、カラシナ等よりSigAホモログをコードするcDNAが単離されているが、相同遺伝子が2種存在する例は、本研究のタバコが初めてである。

　光によるmRNAの蓄積量への影響を調べるために、12時間/12時間の明暗周期で培養したタバコ緑色培養細胞から、3時間おきにtotal RNAを回収し、sigA1のcDNAをプローブとしてノーザン解析を行なった。sigA1とsigA2は極めて相同性が高く、sigA1プローブは、sigA2のmRNAも同時に検出すると考えられる。その結果、sigA1/sigA2のmRNAは暗条件下に比べ、明条件下で多く蓄積していることが判明した。ところが、明暗周期で培養した後、連続明条件下に移してからサンプリングした細胞でも、sigA1/sigA2のmRNA量に明暗周期下と同様な周期性が見られたため、sigA1/sigA2のmRNAの蓄積量は、サーカディアンリズム様の内因性のリズムで増減していることが明らかになった。

　大腸菌で発現させたシロイヌナズナのSigAを抗原に用いて、マウスで単クローン抗体を作成した。この単クローン抗体を用いてタバコ植物体の茎頂分裂組織、若葉、成葉、根などに対してウエスタン解析を行なった結果、SigA相同タンパク質は、特に成葉で多く蓄積していることが明らかになった。また、茎頂分裂組織及び根では、発現しているSigA相同タンパク質の大部分は、トランジットペプチドを含む前駆体タンパク質として存在していることが示唆された。対応するタンパク質がSigA1、SigA2のいずれか、あるいは双方に対応するのかは現在のところ不明である。これらの結果より、SigA相同タンパク質は、プラスチドの形成や分化よりもむしろ、プラスチドの機能の維持に働いていることが示唆される。

　以上のように、本研究において、プラスチドシグマ因子の構造が初めて明らかになり、その発現状況も明らかになってきた。プラスチドシグマ因子が核にコードされていることから、核がシグマ因子の発現を制御することで、プラスチド内の真正細菌型RNAポリメラーゼの転写を制御していると考えられる。本研究で得られた知見は、プラスチドの形成・分化の制御、並びに核とプラスチドのクロストークの解明に、大きく貢献すると期待される。