これまで当研究室で単離されたDMS資化菌にインドールの酸化能は認められなかったことから,はじめにインドール酸化能,DMS資化能,およびDMSのDMSOへの酸化能を有する菌株の取得を行った。その結果取得されたAcinetobacter sp.20B株は,DMSを硫黄源として培養すると培養上清に多量のDMSOが蓄積する事が明らかとなった。この20B株のtotal DNAをXbaI処理して得られたゲノムライブラリーから,インジゴの呈色を示す大腸菌形質転換体が取得された。この形質転換体を用いてDMSを基質に休止菌体反応を行った結果,多量のDMSOが生成することが確認された。この形質転換体の保持するプラスミドを抽出してDMS酸化活性に必須な領域を含むデリーションプラスミドpAU96を作製,挿入断片の塩基配列を決定したところ,この領域には6個のORFが同じ向きにコードされていることが明らかとなった。これらORFの推定アミノ酸配列は,multicomponent phenol hydroxylaseであるMopKLMNOP,DmpKLMNOP等と高い相同性を示したことから,これらをDsoABCDEFと命名した(Fig.1)。またDsoDとDsoFでは活性中心と考えられるモチーフが保存されていた。

Fig.1dso遺伝子と相同性を有するmulticomponent monooxygenase遺伝子の遺伝子構造とアミノ酸レベルの相同性(identity)各遺伝子の下の数字は対応するDsoABCDEFコンポーネントとのアミノ酸レベルの相同性(identity,%)を示す。DsoABCDEFの機能についてはFig.3参照

　DsoABCDEFの各々のタンパク質の機能が対応するDmpKLMNOPの各々の機能と同様であることを確認するため,各々のタンパク質一つずつが欠失したプラスミドを構築し,それらを保持する大腸菌のDMS酸化活性を調べた。DsoABCDEF全てが低コピー数のpSTV28(Cm^r)にコードされているpAS96の場合はDMSOの収率は約30%であり,DsoBCDEFが各々欠失しているpASB〜Fでは酸化活性は失われたが,DsoAが欠失したpASAはpAS96と同程度の酸化活性を示した(Fig.2)。DsoAが酸化活性に不要との結果は,DmpKLMNOPでの報告と合致した。次に,各々で欠失したタンパク質を同じ大腸菌内でpSTV28とoriの異なる多コピーのpUC118/119(Ap^r)から発現させた場合に活性が回復するか調べた。その結果,DsoBCDEF全てで活性は回復したが,DsoDの場合は低い活性しか検出されなかった。EhrtらによってDsoDに相当するMopNは過剰発現すると宿主菌に生育阻害を及ぼすことが報告されており,DsoDの場合も同様に多コピーのpUC118/119ベクターから発現することで宿主菌に阻害を及ぼした可能性が考えられた。また,DsoFの場合に活性の大幅な上昇が観察されたことから,DsoABCDEFが同一遺伝子上にコードされ発現している場合にはDsoFの発現効率が他のタンパク質に比べて低く,DsoFの発現量が活性の律速となっていることが推測された。DmpKLMNOPでも,DsoFに対応するDmpPの発現量が他のタンパク質に比べ少ないことが報告されており,今回の結果もこれと合致していた。次に,DsoABCDEFに対応するDmpKLMNOPの各タンパク質で欠失を相補する実験を行った。DsoA,C,Fの欠失をDmpK,M,Pでそれぞれ相補した場合には,ポジティブコントロールであるpAS96を用いた場合と同程度の活性が検出された(Fig.3)。それに対し,oxygenase componentを構成するDsoB,D,EをそれぞれDmpL,N,Oで相補した場合には,活性の低下が認められた。これらは,oxygenase component中での各タンパク質相互の認識は他のタンパク質間より厳密であるためと考えられた。oxygenase component内ではDsoEとDmpOの相同性は最も低いのにもかかわらず相補によって活性が回復したことから,このサブユニットの認識はoxygenase component内では低い可能性が示唆された。以上のような相補実験の結果より,DsoABCDEFの各コンポーネントの機能はDmpKLMNOPと同様であることが示された(Fig.3)。

Fig.2相補実験における各プラスミドを保持する大腸菌のDMS酸化活性カラム1:pAS96(pSTV28由来,DsoABCDEF),カラム2:pASA〜F(pSTV28/29由来,DsoA〜Fがそれぞれ欠失),カラム3:pASA〜F+pAUA〜F(pUC118/119由来,DsoA〜Fそれぞれをコード),カラム4:pASA〜F+pVI281〜221(pMMBEH/HE由来,DmpK〜Pそれぞれをコード)

Fig.3DsoABCDEFの各コンポーネントの推定機能

　今回DMS酸化活性を有する酸化酵素として単離されたDsoABCDEFは従来phenol hydroxylaseとして単離されていた多くの酸化酵素と極めて類似しており,phenol hydroxylaseを含め,他の既知の芳香族化合物酸化酵素もDMS酸化活性を有する可能性が考えられた。そこで,DsoABCDEFと類似の遺伝子構造を有するDmpKLMNOP,AphKLMNOP,TbmABCDEF,single component phenol hydroxylase(TfdB),multicomponent dioxygenaseであるcumene dioxygenase(CumA1A2A3A4),toluene-xylene dioxygenase(XylMA),naphthalene-phenanthrene dioxygenase(PahAaAbAcAd),carbazole dioxygenase(CarAaAcAd),およびdibenzothiophene dioxygenase(SoxC)の各種酸化酵素の,DMSからDMSOへの酸化活性を調べた。この際,必要があればベクターの組換えを行って,酸化酵素は全てpUC18/19,またはpUC118/119から発現されるようにした。DsoABCDEFと類似の遺伝子構造を有するDmpKLMNOP,AphKLMNOP,TbmABCDEFはDMSの酸化活性を有することが明らかとなったが,AphKLMNOP,TbmABCDEFの活性はDsoABCDEF,DmpKLMNOPと比較し非常に低かった(Fig.4)。Single component phenol hydroxylaseのTfdBにはDMS酸化活性はほとんど見いだされなかった。その一方で,multicomponent dioxygenaseであるCumA1A2A3A4,XylMA,PahAaAbAcAdにもDMS酸化活性が認められた。Dibenzothiopheneの硫黄原子に対する酸化活性を有する事からDMSの酸化活性も期待されたCarAaAcAd,SoxCにはDMSの酸化能は認められなかった。これらの結果より,遺伝子構造の類似性とは無関係に,様々な酸化酵素がDMS酸化活性を有している可能性が示された。

Fig.4各種酸化酵素のDMS酸化活性

　本研究では土壌からDMS資化菌Acinetobacter sp.20B株を単離すると共に,20B株からDMS酸化活性を有する酵素遺伝子dsoABCDEFの単離と解析を行い,DsoABCDEFはDmpKLMNOP等,multicomponent phenol hydroxylaseと高い相同性を示すことを明らかにした。DmpKLMNOPとの相補実験からは,DsoABCDEFの各タンパク質は対応するDmpKLMNOPの各タンパク質と同様の機能を有することが示唆された。また,本研究によって様々な酸化酵素がDMS酸化活性を有することが示された。今回DMS酸化活性を有することが明らかとなった酸化酵素には全てインドールの酸化活性が認められたこと,また,本実験でDMS資化菌として単離された多数の菌株のうちインドール酸化能を有する菌株はごく少数であったことから,DsoABCDEFのように芳香族化合物にも酸化活性を有する酸化酵素とは異なるタイプのDMS酸化酵素が多く存在するものと考えられる。DMS変換における微生物の果たす役割を解明するためには,今後はこれら未同定のDMS酸化酵素遺伝子を解析していくことが必要と考えられる。