15株のtolZ変異株(表現型はTol^-,Nfc^-あるいはTol^-,Nfc⁺)にプラスミドによりftsH遺伝子を導入したところ、全ての株で変異株の表現型は回復した。そこでそのうち4株から変異ftsH遺伝子をプラスミドにクローニングし塩基配列を調べた。その結果、ftsH遺伝子中に変異が見い出され、一アミノ酸残基の置換、挿入、一塩基欠失によるフレームシフト、一塩基置換のサイレント変異、といった4株それぞれから全く異なる変異が検出された。

　tolZ変異株KHl10は、弱いTol^-を示すがNfc⁺という、野生型に近い表現型を持っていた。この変異株のtolZ遺伝子に見い出された一塩基置換のサイレント変異により、開始コドンから第8番目のコドンCUA(Leu)がCUC(Leu)に変化していた。どのような機構で、このサイレント変異によりTol^-表現型が現れたのかを調べた。

　変異株KHl10のFtsH蛋白質の量を抗FtsH抗体を用いたWestern blottingにより調べたところ、野生株に比べて大幅に減少していた。ロイシンのコドンCUCは、CUAに比べてtRNA存在比と使用頻度が大きく上回っていることが知られており、この実験事実は矛盾しているように見えた。そこで、同じ位置における他のサイレント変異(CUG,CUU)を作成し、比較したところ、その位置の変異塩基がCである場合にのみ、FtsH蛋白質の量の減少が見られることがわかった。mRNAの二次構造予測により、その塩基はSD配列を含むstem-loop構造の端に位置し、塩基がCになることで、反対側の塩基Gと塩基対を形成すると推測された。その一塩基対合により、恐らくSD配列付近の構造が変化し、リボソーム結合による翻訳開始の効率が低下したと考えられる。Northern解析によっても翻訳レベルでの差異であることが、確かめられた。

　これによりFtsH蛋白質の変異だけでなく、FtsH蛋白質の量の減少によってもTol^-表現型が発現することが明らかとなった。

　tolZ21変異株UM21はTol^-,Nfc^-の表現型を示し、亜鉛依存性プロテアーゼFtsHの亜鉛結合モチーフに変異があることから、この変異株のFtsH蛋白質はプロテアーゼ活性を欠いているものと考えられる。既に当研究室において、変異株UM21で、膜内外のプロトン勾配の形成に重要な役割を果たす呼吸鎖末端酸化酵素シトクロムbd複合体について、機能と分光学的性質に異常が検出されている。その異常が蛋白質レベルではどのように捉えられるかを、Western blottingにより、H⁺-ATPaseとともにそれらの発現量を調べた。その結果、H⁺-ATPaseでは変化が見られなかったのに対して、シトクロムbd複合体では二つのサブユニットどちらも、変異株UM21は野生株と比べて、約10分の1程度の量に減少していた。そこで、変異株UM21でシトクロムbd複合体をプラスミドにより発現させたところ、野生株と同じ程度の量の蛋白質が作られているにもかかわらず、Nfc^-の性質には変化が無かった。こうしたことから、FtsH蛋白質がシトクロムbd複合体の膜へのアッセンブリー、構造形成などに関わっていることが示唆されたが、Nfc^-の表現型がシトクロムbd複合体のみの欠陥に起因するのではないことも明らかになった。

　tolZ21変異株UM21はTol^-,Nfc^-であるが、Nfc^-のみがNfc⁺に変化した自然復帰変異株が高頻度で得られた。その復帰変異株におけるサプレッサー変異遺伝子について、ミニトランスポゾンを用いて染色体上の位置を決定し、DNA塩基配列決定により変異を検出した。その結果、10株中9株がenvA(lpxC)遺伝子内に変異が検出された。それらの変異は、6アミノ酸残基の重複、保存性の高いアミノ酸残基の置換が2種、という3種類に分けられた。一方、既にLpxC蛋白質はFtsH蛋白質の基質となることが報告されている。このように、Nfc^-のサプレッサー変異遺伝子が基質であったことからも、FtsHが蛋白質分解による制御において重要な役割を担っていることが示唆された。

　膜貫通領域を欠失し、C末端側の細胞質領域のみを持つ水可溶性型FtsHでは、³²分解活性が極めて低く、Tol^-の表現型回復もしないことから、膜貫通領域がこの酵素の機能に大きく関わっていることが示唆された。そこで、膜貫通領域とこの酵素の機能の関係を調べるため、FtsH蛋白質のN末端領域のそれぞれ異なる位置(第一の膜貫通領域直前、直後、ペリプラズム領域内、第二の膜貫通領域直前、直後)にmaltose-binding protein(MBP)を融合させ、5種類のMBP-FtsH融合蛋白質を作成した。これらを菌体内で発現させると、可溶性画分に生産された。これらを精製し、³²分解活性を測定したところ、第二の膜貫通領域以降を持つものではほぼ同様に³²を分解したが、C末端側の細胞質領域のみを持つものでは分解しなかった。ATPase活性はどの形でも保持していたが、C末端側の細胞質領域のみを持つものでは約10分の1程度に活性が落ちていた。沈降速度法による超遠心分析により、第二の膜貫通領域以降を持つものは多量体を形成していたのに対し、C末端側の細胞質領域のみを持つものは単量体で存在していると考えられた。

　以上より、FtsHは、単にC末端側の細胞質内の領域のみでは機能せず、³²分解、多量体形成においては、第二の膜貫通領域を含めたC末端領域が必要であることがわかった。

　膜蛋白質であるFtsH蛋白質が膜へ局在することの意義解明と、FtsH蛋白質の機能の分割を目指して、膜貫通領域のあるN末端側を欠失した変異蛋白質をtolZ21変異株で発現させ、それによる表現型の回復を調べた。上記5種類のMBP-FtsH融合蛋白質を発現させたところ、N末端側を欠失したどの変異蛋白質でもNfc^-の表現型は回復しなかったが、Tol^-の表現型は第二の膜貫通領域以降を持つものでは回復した。さらに、シグナルペプチド付きのMBPを用いた膜局在型MBP-FtsH融合蛋白質でも、Tol^-の表現型のみ回復が見られた。このことから、Tol^-の表現型回復には、Nfc^-の表現型回復に必要なFtsHの機能のうちの一部分(恐らくプロテアーゼ活性)だけで可能であると考えられる。