カルパインは高等動物の細胞質内に存在し、カルシウムによって活性化されるシステインプロテアーゼである。カルパインには初期の研究においてタンパク質レベルで発見された組織普遍的に存在する分子種と、90年代に入り、核酸レベルの相同性をもとに発見されてきた組織特異的な分子種がある。カルパインの生理機能や構造と機能相関の解析において、タンパク質レベルでの解析が必要であることは疑う余地はない。組織普遍的なカルパインのタンパク質レベルでの研究はかなり進んでいるが、組織特異的カルパインのほとんどは核酸レベルで同定されているだけでタンパク質レベルでの生化学的解析は遅れている。また組織普遍的、特異的カルパインを問わず、さまざまな変異体を利用した解析は構造と機能の研究には必須であり、そのためにはカルパインの大量発現系の確立が重要である。発現系には大腸菌、酵母、枯草菌、培養細胞を用いたものなどがあるが、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞の系はカルパインなど高等動物のタンパク質を発現する場合には生理活性のあるタンパク質が発現する可能性が高く、また強力なポリヘドリンプロモーターを使用しているため大量に発現しやすい傾向がある。これまでバキュロウイルスの発現系では組織普遍的カルパインの一つである-カルパインの発現が報告されているが、活性化に必要なCa²⁺感受性が異なるもう一つの主要な組織普遍的カルパインであるm-カルパインの発現は報告されていない。そこでm-カルパインに着目することにし、バキュロウイルスを用いたカルパインの大量発現系を確立した。次にバキュロウイルスのカルパイン発現系を用い、変異型カルパイン、組織特異的カルパイン等を発現・精製し、精製標品の様々な性質を解析した。

　m-カルパインは天然臓器から、プロテアーゼドメインとCa²⁺結合ドメインを持つm80KサブユニットとCa²⁺結合ドメインを持つ30Kサブユニットからなるヘテロダイマーとして精製される(図1)。そこでm-カルパインを発現するために、m80Kバキュロウイルスと30Kウイルスを作製し、昆虫細胞Sf9に共感染した。発現後、細胞破砕液の上清にカルパイン活性が確認できたので、天然m-カルパインと同様に、DEAE-Toyopearl、ゲル濾過Superdex200、Mono Qとカラムクロマトグラフィーを行ったところ、ほぼ単一まで精製できた。精製標品はヘテロダイマーであり、Ca²⁺感受性(Ka＝0.4mM)、比活性(カゼイン分解活性;690U/mg)、至適pH(pH7.8)は、天然ウサギm-カルパインの性質とほぼ同一であった。また1Lの細胞懸濁液から約20mgの精製m-カルパインが得られ、バキュロウイルスを用いた発現系が質的にも量的にも優れていることが明らかになった(以上の結果を文献1に発表)。

　次にm-カルパインの発現系を利用して活性中心のシステインをセリンに置き換えた変異体、m-C105S-カルパインを同様な方法で、感染、発現及び精製した。精製標品は、Ca²⁺依存的なプロテアーゼ活性(自己消化活性、カゼイン分解活性、人工基質SLLVY-MCA分解活性)は全く検出できなかった。パパインの場合には活性中心のシステインをセリンに変換した変異体が弱いながらもセリン酵素としての活性を示すが、カルパインの場合には同様な変換で活性は完全に失われた。天然型のm-カルパインはCa²⁺存在下で自己消化を起こして分解するが、今回作製したm-C105S-カルパインはCa²⁺存在下で安定なので、Ca²⁺存在下でのカルパインの構造研究の良い材料になり、Ca²⁺によるカルパインの活性化機構解明に役立つことが期待される。

　Ca²⁺によりカルパインが活性化する時には、自己消化、大小サブユニットの解離、活性発現がほぼ同時に起き、非常に複雑な現象が起きる。よって活性化機構解明の一方法として、X線回折等による構造学的側面からの解析が急務であったが、大量発現系が確立されるまでは結晶化のためのサンプルを大量に天然臓器から精製することは難しかった。また天然型のカルパインはその自己消化能のため、Ca²⁺結合型の構造を解析することは不可能だった。これまでカルパインに関しては小サブユニットのCa²⁺結合ドメインの結晶構造が報告されているのみであったので、全長のカルパインの結晶化を試みた。確立したのバキュロウイルスの系を用いて、結晶化に使える純度の高いm-カルパインを150mg、m-C105S-カルパインは210mg精製し、その大半を結晶化材料とした。結晶化はドイツのMax Planck研究所のW.Bode教授、S.Strobl博士との共同研究で、初めてm-カルパインの結晶を得ることに成功した(図2)。

　m-C105S-カルパインはCa²⁺存在下、および非存在下で結晶が得られているが、現在のところ良好な回折像が得られていない。

　m-カルパインの構造と機能相関を解析するため80Kのさまざまなフラグメントをバキュロウイルスの系で作製した。第1ドメインから第3ドメインの途中までのカルパインフラグメント(mCL/2’)は特に発現が良かったため、これを精製、性質決定することにした。発現後、ウエスタンブロッティングにより細胞破砕液の上清にタンパクが確認できたので、天然m-カルパインと同様に、DEAE-Toyopearl、ゲル濾過Superdex200、MonoQカラムによる精製を行った。精製標品は非常に弱いCa²⁺依存的自己消化活性と、カゼイン分解活性をもっていた。またE64で2つの活性は阻害された。しかし、潜在的なCa²⁺結合部位が存在するにも関わらず、⁴⁵Ca²⁺の結合アッセイ(カルシウムオーバーレイ法)ではCa²⁺の結合は検出できなかった。

　組織特異的カルパインの解析は、カルパインの生理機能解明の突破口になることが予想されて非常に重要であるが、タンパク質レベルでの解析は遅れていた。それは酵素の天然臓器からの精製が非常に困難であったからである。nCL-2’はスプライシングの違うnCL-2とともにmRNAが胃(平滑筋)に特異的に発現し、Ca²⁺結合ドメイン(第4ドメイン)が存在しないことから、その特異的な役割が推測され、注目されている。住血吸虫Schistosoma mansoniのカルパインの研究から、このnCL-2’にも第2ドメインと第3ドメインの境界に潜在的なEF-ハンド構造が存在することが予想されるため、生体内でCa²⁺によって制御されている可能性がある。今回バキュロウイルスの系を用いて初めて胃特異的に発現しているnCL-2’を単一まで精製することに成功した。精製標品には弱いCa²⁺依存的な自己消化活性が検出できたが、E64により自己消化阻害はされなかった。またカゼインや人工基質SLY-MNAの分解活性は検出できなかった。

　バキュロウイルスの系で発現させた組換えm-カルパインは十分な活性を持ち天然の酵素と区別できないことが明らかになった。またこの発現系は量的にも優れていたので結晶解析のための十分な材料を得ることが出来た。さらにバキュロウイルスの系を用いてこれまで天然臓器から精製が困難だった組織特異的カルパインp94,nCL2,nCL-2’,nCL-4,capn5,6を大量に調製することが可能になり、これらの酵素のタンパク質レベルでの解析に有用であることが分かった。本研究ではその中でnCL-2’の発現に初めて成功し、性質を調べた。nCL-2’の酵素活性は非常に弱く、本来の基質、活性化因子の検索が必要である。

　1)Masumoto,H.,Yoshizawa,T.,Sorimachi,H.,Nishino,T.,Ishiura,S.,and Suzuki,K.(1998)Overexpression,Purification,and Characterization of Human m-Calpain and Its Active Site Mutant,m-C105S-Calpain,Using a Baculovirus Expression System.J.Biochem.124,957-961

図1 発現させたカルパイン及びフラグメント

図2 m-カルパインの結晶