脳神経系は生物が生きていく上で欠かすことのできない情報を受容し、処理し、伝達する複雑なシステムである。ヒトの脳にはおよそ10¹¹個の神経細胞が存在し、それらが10¹⁴ものシナプス結合を形成して神経回路網を構築している。この構造的にも機能的にも複雑な脳神経系の形態形成および維持に不可欠な蛋白質因子として神経成長因子(NGF)に代表される神経栄養因子は発見された。NGFは細胞表層に存在する受容体型チロシンキナーゼTrkAを介して細胞内情報伝達系を活性化し、神経突起伸長や生存維持作用などさまざまな生理作用を示す。これまでにNGFが誘導する細胞内情報伝達系は蛋白質リン酸化リレーにより巧妙に制御されていることが明らかとなっている。一方、このような栄養因子による刺激を増強・修飾する活性物質は、情報伝達の過程を解明してゆく上で有用であるばかりでなく、臨床などの応用面でも利用価値が高いと考えられる。

　当研究室ではこのような背景を踏まえ、神経突起伸長に対して作用を有する活性物質のスクリーニングを行い、Helicosporium属のカビが生産する相対分子量15kDaの蛋白質p15を見出した。p15はPC12細胞に対して、NGFが誘導する突起伸長を顕著に亢進することが明らかにされている。本研究ではこのp15をプローブに用い、神経突起伸長に関わる細胞機能の調節機構を明らかにすることを目的として解析を行った。

　p15は70%アセトン中でも沈殿せず活性を保持する性質を持つ。この性質を利用して菌体から70%アセトンによる抽出を行い、PC12細胞からNGFが誘導する突起伸長を増強する作用を指標として、硫安沈殿、陰イオン交換カラムを用いてp15を精製した。アミノ酸組成分析の結果、p15はアミノ酸118残基から構成されることが明らかになった。さらにAchromobactorプロテアーゼI、エンドプロテアーゼAsp-Nによる酵素消化断片、臭化シアンおよびBNPS-スカトールによる化学分解断片のアミノ酸配列をそれぞれ自動エドマン分解法により決定し、p15の全アミノ酸配列を決定した。またジスルフィド結合の位置を決定する目的で、p15に対して還元下、非還元下にヨード酢酸によるSH基の修飾を行い、それぞれのアミノ酸組成およびAchromobactorプロテアーゼI消化断片の質量を比較した。その結果、p15には2組のジスルフィド結合が存在することが明らかになった。

　一方、p15の遺伝子構造を明らかにするため、決定したアミノ酸配列から複数の混合オリゴヌクレオチドを作製し、生産菌のゲノムを鋳型としたPCRを行った。その結果、アミノ末端およびカルボキシル末端をもとに作製した混合オリゴヌクレオチドの組み合わせから、1つのイントロンを含み、p15の成熟体部分のアミノ酸配列をコードするDNA断片を取得した。決定したアミノ酸配列および塩基配列をもとにデータベース検索を行ったが有意な相同性を持つ配列は見出されず、p15が新規な作用機序により生理作用を示すことが示唆された。

　p15はPC12細胞に対し、単独では突起伸長を示さない低濃度NGFの作用を顕著に亢進し、突起伸長を誘導する。一方NGF依存的に生育することが知られる初代培養後根神経節神経細胞に対するp15の作用を検討したところ、低濃度NGF存在下での生存維持作用を示すことがわかった。こうしたp15の作用がNGFシグナルに特異的なものかどうかを調べる目的で、NGF以外の刺激に対するp15の添加効果をPC12細胞からの突起伸長を指標にして調べた。その結果、p15は40mM KClによる脱分極刺激、および線維芽細胞増殖因子による突起伸長誘導も顕著に亢進した。こうしたp15の刺激増強作用はL型Ca²⁺チャネルの阻害剤ニカルジピンで抑制された。

　また、培養基質を変更することにより、p15が単独でも突起伸長誘導能を持ち、神経突起のマーカーであるニューロフィラメントMの発現を誘導することがわかった。この場合もニカルジピンの濃度に依存して突起伸長が抑制された。一方、p15単独の処理による突起伸長はTrkAの阻害剤K252aでは全く抑制されなかった。さらに、Ca²⁺キレート剤BAPTA/AMおよびCa²⁺-freeの培地を組み合わせた培養系ではp15による突起伸長は誘導されなかった。増殖因子や脱分極による突起伸長刺激は細胞内へのCa²⁺流入により増強されることが知られている。以上の結果から、p15がCa²⁺シグナル伝達系に作用すること、低濃度NGFに対する増強効果はその活性化を介した現象であることが強く示唆された。

　上記の結果より、p15はCa²⁺の細胞内流入を誘導するものと予想された。しかし蛍光Ca²⁺指示薬Fura-2を用いてp15処理したPC12細胞内のCa²⁺濃度の変化を調べたところ、顕著な上昇は認められなかった。そこでCa²⁺シグナル伝達系において下流に位置する因子の活性化を調べることにより、p15の作用が同シグナル系を経由するかどうかを検討した。脱分極刺激に伴うCa²⁺流入が誘導する細胞内情報伝達系には諸説あるが、非受容体型チロシンキナーゼSrcを介した経路が有力視されており、活性化されたSrcは低分子量G蛋白質Rasを含む複数のシグナルを活性化することが知られている。そこで優性不活性型Rasを発現するRasN17細胞、あるいは優性不活性型Srcを発現するSrcDN細胞を用いてp15の突起伸長誘導作用を調べた。その結果、RasN17細胞ではp15を与えた場合には細胞体から棘状のスパイクが生じる部分的な形態変化が認められたが、SrcDN細胞では全く影響が認められなかった。さらに抗Src抗体による免疫沈降物を用いてそのチロシンリン酸化能をELISA法により測定したところ、p15の刺激によりSrcが活性化することが分かった。これらの結果から、p15はSrcを介して突起伸長を誘導することが明らかになった。また、p15の突起伸長誘導作用とMAPK(mitogen-activated protein kinase)カスケードとの関連を調べる目的で、MEK(MAP/ERK kinase)阻害剤PD98059を用いてp15あるいはNGFが誘導する突起伸長への影響を比較した。その結果、同阻害剤の存在下ではNGFが誘導する突起伸長は強く阻害されるのに対し、p15が誘導する突起伸長は部分的にしか阻害されなかった。さらにミエリン塩基性蛋白質(MBP)を基質としたゲル内リン酸反応においても、p15で刺激した場合には刺激後5minに一過性の活性化が認められたが、NGFに見られるような持続した強い活性化は認められなかった。したがって、NGFによる突起伸長がMAPKカスケードに強く依存するのに対し、p15による突起伸長ではその他の経路も必要とすると考えられる。一方、ビオチン標識したp15をPC12細胞に作用させ、アビジン結合FITCで検出すると細胞表層が染色された。以上の結果を総合すると、p15は細胞表層に存在する何らかの分子を介して細胞に結合し、L型Ca²⁺チャネルの機能に影響することにより、Ca²⁺シグナル伝達系を活性化していると結論した。

　p15と類似の作用を有する蛋白質としてコレラトキシンBサブユニット(CTB)が知られている。CTBはガングリオシドGM1を介して細胞膜に結合し、L型Ca²⁺チャネルの機能を促進的に修飾することが明らかになっている。p15の配列は新規であり受容体の予想は困難だが、今後は細胞膜表在性の脂質類を含めた検討が必要であると思われる。

　神経系では神経細胞の生存、軸索の伸長、シナプスの可塑性など、Ca²⁺が担う役割は多岐にわたる。またシナプス予定領域と考えられる成長円錐には成熟シナプスとは異なりL型Ca²⁺チャネルが量的にも多く、機能的にも活性があることが明らかになっている。本研究で得られた知見により、p15が新たなCa²⁺シグナル経路を解明する手がかりになると期待している。