A-ファクター欠損株であるS.griseus HH1からUV処理により取得されたS.griseus HO2株は、A-ファクターが存在しないにもかかわらず、Sm生産と気中菌糸・胞子形成を行うことができる変異株である。A-ファクター結合アッセイ及び抗ArpA抗体を用いたウエスタン解析によって、HO2株におけるArpAの発現量が非常に少ないことを明らかにした。しかしながら、HO2株にarpA遺伝子をハイコピーで導入しても、野生株とは異なり気中菌糸・胞子形成およびSm生産は抑制されなかった。この結果よりHO2株はArpAだけでなく、A-ファクター制御カスケードの下流あるいは他の制御系に変異が起こっていると予想された。

　HO2株の変異遺伝子あるいはA-ファクター制御カスケードの下流や他の制御系の遺伝子の取得を目指し、HO2株を宿主としたショットガンクローニングを行った。その結果、多コピーベクターによりHO2株に導入することによりHO2株の気中菌糸形成及びSm生産を抑制する遺伝子として、野生株の染色体DNAより約3kbのDNA断片を取得した。サブクローニングの結果、そのC末端側が真核生物型のadenylate cyclase(cAMP合成酵素)と非常に高い相同性を有するORFがこの形質に関与していることを見い出した。cyaAと命名されたこの遺伝子をHO2株に多コピーベクターで導入すると、細胞外のcAMPの濃度は対数増殖期の中程まで増加し続け、ピーク時はベクターのみを導入したものの5倍以上になった。また、種々の濃度のcAMPをしみこませたペーパーディスクをおいたプレート上に生育させたHO2株の観察より、高濃度のcAMPは形態分化およびSm生産を抑制することが明らかになった。以上の結果よりHO2株では、導入されたcyaA遺伝子によって大量に生産されたcAMPが気中菌糸形成及びSm生産を抑制しているものと考えられた。一方、HO2株において低濃度のcAMPは逆に形態分化およびSm生産を促進することも観察された。興味深いことに、これらのcAMPが二次代謝・形態分化に及ぼす影響はHO2株以外のArpA変異株でも同様に観察されたが、野生株ではほんの僅かしか観察されなかった。このことは野生株においては我々の目に見えてこなかった現象がArpA変異株を用いることにより解析できることを示している。これまでグラム陽性菌においてcAMPが信号伝達物質として報告された事例は皆無であり、今回得られた結果は重要であると考えている。

　細菌の二次代謝や形態分化は栄養源の枯渇に応答して起こることがよく知られている。栄養源が枯渇した状況におかれた細菌においてはRNA合成の停止をはじめとした多面的制御機構(緊縮調節)が働く。ppGppはこの緊縮調節に関連する物質の1つであり、細胞内での蓄積がS.griseusのSm生合成を誘導すること、またppGppの増加に伴うGTP poolの減少が気中菌糸形成を誘導することが示されている。ATPから変換されるcAMPも細胞内のnuclotide poolに影響する可能性があると予想されたため、cyaA遺伝子を導入したHO2株の細胞内のppGpp量の経時的な変化を調べた。HO2株にベクターのみを導入すると気中菌糸形成に伴って細胞内ppGpp量が急激に増加するのに対して、cyaA導入株においてはppGpp量の増加は観察されなかった。この結果から高濃度のcAMPがHO2株の二次代謝・形態分化に及ぼす影響は、高濃度のcAMPがppGppの生産を抑制することによって緊縮調節が起こらないために引き起こされるという可能性が示唆された。

　真核細胞において、様々なチロシンキナーゼが信号伝達、細胞増殖、代謝などを制御することがよく知られているが、セリン/スレオニンキナーゼと違い、cyclic-nucleotideに依存的な制御についての報告はこれまでになかった。しかしながら、最近、AcinetobacterのチロシンキナーゼがcAMPによって活性化されることが報告された。放線菌においてもチロシンキナーゼが存在し、それが二次代謝と形態分化の制御に関与している可能性が示唆されているため、HO2株において観察されたcAMPの二次代謝と形態分化に及ぼす効果は、チロシンリン酸化蛋白を介して引き起こされている可能性があると考え、チロシンリン酸化蛋白のリン酸化パターンの経時的な変化を抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタン解析により調べた。

　野生株では培養初期から既に9つ以上の蛋白がチロシンリン酸化され、mid-log phase(decision phase:細胞が二次代謝と形態分化に入るかを決定する時期)以後これらの蛋白のリン酸化は急激に減少した。これに対して、HO2株の場合は培養初期にはこれらの蛋白のチロシンリン酸化は抑制され、decision phaseから急激にリン酸化されるという、野生株と全く逆の結果が得られた。このパターンは他のArpA変異株でも同じであったことから、ArpA変異とチロシンリン酸化との間に密接な関係があることが示された。一方、cyaA遺伝子をHO2株に導入すると、定常期に入るまでチロシン残基のリン酸化が抑えられることが明らかになった。この結果より、1つあるいは複数の蛋白のチロシンリン酸化が二次代謝と形態分化に非常に重要であること、またこの蛋白のチロシン残基のリン酸化がcAMPによって抑えられることが予想される。

　以上の結果は、グラム陽性菌である放線菌においてcAMPが二次代謝、形態分化に必須ではないものの重要な制御を行うことを示しており、グラム陽性菌ではこれまで知られていない発見である。A-ファクターレセプター欠損株を用いることにより、今後cAMPの役割の分子レベルでの解析が可能となった。

　蛋白のリン酸化が放線菌の二次代謝と形態分化に重要な役割をすることが、関連キナーゼ遺伝子のクローニング及びキナーゼ阻害剤を用いた実験を通して明らかになっている。しかし、真核細胞の増殖、分化、癌化などに非常に重要であることが知られているチロシンホスファターゼに関しては放線菌ではほとんど研究されていない。そこで、様々なホスホチロシンホスファターゼ阻害剤が放線菌の二次代謝と形態分化に及ぼす影響を調べた。その結果、バナデート(Na₃VO₄)が複数の放線菌の二次代謝と形態分化を抑制することが明らかになった。そこでバナデート存在下で気中菌糸形成及びSm生産能を回復する変異株の取得を試み、野生株のUV処理によりS.griseus VHK2株を取得することに成功した。

　VHK2株における変異遺伝子の取得を目指し、野生株を宿主としたショットガンクローニングを行った。その結果、多コピーベクターにより野生株に導入することによりバナデート存在下での気中菌糸形成及びSm生産能を回復させる遺伝子として、VHK2株の染色体DNAより約1.8kbのDNA断片を取得した。塩基配列を決定した結果、二成分制御系ヒスチジンキナーゼと非常に高い相同性を有するORFが見い出された。さらに、このヒスチジンキナーゼによってリン酸化されると予想される応答制御因子がこのキナーゼの上流に存在することが明らかになった。現在、このような二成分制御系がどのようにしてバナデート存在下での気中菌糸形成及びSm生産能を回復させるかに関しての解析を進行中である。酵母の浸透圧を感知するMAPキナーゼカスケードを構成するセリン/スレオニンキナーゼの上流に二成分制御系ヒスチジンキナーゼと応答制御因子が存在することが報告されていることから、放線菌においても二成分制御系が真核生物型のキナーゼカスケードの上流にある可能性があり興味深い。