出生初期、雄性生殖細胞(Gonocyte)は増殖を再開し、精細管基底膜への定着を始める。これら2つの現象は、精子発生の基盤として重要であるにもかかわらず、そのメカニズムついてはほとんど知られていない。Gonocyteの増殖再開と基底膜への定着の相互の関わりをBrdU(5-bromodeoxyuridine)標識法と電子顕微鏡を用いて調べた。

　方法:C57BL/6Jマウスの胎仔(Day13.5post coitum(dpc)-18.5dpc)と新生仔(Day0.5post partum(dpp)-8.5dpp)の皮下にBrdU(0.005mg/g body weight)を投与した。投与2時間後、BrdU標識Gonocytを免疫組織化学的に確認し、顕微鏡下で計数し、解析した。さらに、電子顕微鏡によって形態観察を行った。

　移動中のGonocyteは17.5dpcから観察され、18.5dpcからは基底膜に完全に定着したGonocyteが認められた。BrdU標識Gonocyteは1.5dpp(13.2%)から確認され、2.5dppで急激に増加した。その後も日齢にともなって徐々に増加した。上述のように定着-BrdU非標識Gonocyteは18.5dpc(1.4%)から認められ、定着-BrdU標識Gonocyteは1.5dpp(7.8%)から観察されるようになった。一方、未定着-BrdU標識Gonocyteは1.5dpp(5.2%)から確認された。

　Gonocyteは、胎生後期に、増殖再開より早く移動・定着を始める。また、出生後、2現象はランダムに生じる。これらの結果から、Gonocyteの増殖再開は定着と一致せず、移動および増殖再開はそれぞれ独自のメカニズムによって生じることが示唆された.

　前精子形成期のC57BL/6Jマウスの雄性生殖細胞は、16.5dpcで増殖を完全に停止し、精細管の基底膜への移動を開始する。出生後、再びGonocyteは増殖を再開させ精子発生へと至る。しかし、これらの分化に関する情報は極めて少ない。マウス精巣の分化にともなうGonocyteとSertoli細胞における複合糖質の変化を、22種類のレクチンを用いて光学顕微鏡によって観察した。

　方法:C57BL/6Jマウスの精巣(16.5dpc〜6.5dpp)を採取し、レクチン組織化学(ABC法)を行った。

　sWGA,VVA,およびLEAは、前精子発生期のGonocyteとSertoli細胞に特異的な結合パターンを示した。sWGAの陽性反応は、16.5dpcのGonocyteの細胞質と細胞膜に認められた。この反応性は徐々に減少し、出生後の1.5dppで完全に消失した。しかし、4.5dppで再びGonocyteと一部のSertoli細胞に陽性反応が観察されるようになった。VVAは0.5dppからGonocyteの細胞膜に弱陽性反応を示し、この反応性は6.5dppまで続いた。LEAは16.5dpcからGonocyteの細胞膜および細胞質、Sertoli細胞の細胞膜に陽性反応を示し、この反応性は6.5dppまで続いた。

　sWGA,VVA,およびLEAはGonocyteのマーカーとして有用であり、特にsWGAとVVAは、前精子発生期のGonocyteの分化に関与することが示唆された。

　Gonocyteの増殖再開は、ある種の因子に誘導されることが示唆されているが、未だその実体は解明されていない。我々は、新たに確立した新生仔精巣の器官培養系を用い、Gonocyteの増殖再開誘導因子の解析を試みた。

　16.5dpcと0.5dppの精巣器官培養系を確立し以下の実験を行った。(1)血清添加培地群(10%ウシ胎仔血清(FBS)・新生子ウシ血清(CS)、血清代替培地群(10〜20%成体精巣抽出液,10%の1.5dpp,2.5dppおよび3.5dpp精巣抽出液、および10%成体卵巣抽出液)で1〜3日間培養後、BrdUを投与しGonocyteの増殖率を調べ,in vivoと比較した。(2)高い増殖率を示したCSと成体精巣抽出液を選び、熱処理・Charcol-Dextran処理・ProteaseK処理、またCSのみを限外濾過によるタンパク濃縮処理を行ったものを培養系に添加し1〜3日間培養後,BrdUを投与し増殖率を調べた。(3)CSと成体精巣抽出液をあらかじめ抗Testosteroneポリクローナル抗体,抗Eestradiol-17ポリクローナル抗体,および抗Progesteronポリクローナル抗体によって中和させ、1〜3日間培養後,BrdUを投与し効果を調べた。(4)CS,Charcol-Dextran処理したCSおよび精巣抽出液に含まれるTestosterone濃度をRIA(radioimmunoassay)によって測定した。(5)既知のステロイド(Testosterone Propionate,Estradiol-17,およびProgesterone)を1ng/ml〜1000ng/ml添加し、1〜3日間培養後,BrdUを投与し増殖率を調べた。また、コントロール試験として、更にこの条件下に既知のステロイドに対する中和抗体を用いた。

　(1)培養後1日目で,0.5dppの精巣器官培養系の10%CS添加,20%成体精巣抽出液、2.5dppおよび3.5dpp精巣抽出液各添加群において,GonocyteのBrdU標識が観察された(それぞれ、33.3%,20.8%,18.5%,および7.3%)。0.5dppの他の条件下では、培養後2日目からGonocyteの増殖が再開した。一方、16.5dpcの精巣器官培養系ではいずれの条件下でも、3日間BrdU標識Gonocyteは全く認められなかった。(2)培養後1日目に、Charcol-Dextran処理が著しくGonocyteの増殖を抑制した。次にCSのみを限外濾過によるタンパクの濃縮処理(10Kおよび1K)を行ったところ、培養後1日目に、10K以上、1K以上、1K以上+Charcol-Dextran処理した1K以下の添加群がGonocyteの増殖性を著しく抑制した。これらの結果かsteroid様の因子がGonocyteの増殖に関与することが推測された。(3)CSと成体精巣抽出液を市販の抗Testosteroneポリクローナル抗体(3.1%,4.6%)、抗Estradiol-17ポリクローナル抗体(3.6%,13.4%),および抗Progesterone(16.3%,12.2%)ポリクローナル抗体とそれぞれ中和させたものを培地添加剤として培養したところ、抗Testosteroneポリクローナル抗体添加群が最もGonocyteの増殖率を抑制した(3) Testosterone濃度は、CS中では211pg/ml、Charcol-Dextran処理したCSは146pg/ml、および成体精巣抽出液は6574pg/mlであった。(4)Testosterone propionate,Estradiol-17,Progesteronをそれぞれ1ng/mlの濃度で添加したところBrdU標識Gonocyteは、28.3%,12.8%,および0.5%であった。

　Gonocyteの増殖再開の誘導は、培養1日目が外因性の刺激に感受性が高く、培養後2日目以降は精巣内のみの因子で増殖することが明らかになった。また、in vitroでTestosteroneが最もGonocyteの増殖誘導に効果を発揮する因子のひとつとして深く関与することが示された。

　生殖細胞系譜には、分化段階によって様々な制御メカニズムが用意されているようである。今回の我々の実験からも、0.5dppと同条件で16.5dpcの精巣器官培養を3日間行ったところGonocyteは、全く増殖しなかった。Gonocyteは培養後1日目以降はDMEMのみでも増殖することや、生化学的処理を施しても影響を受けるのは培養後1日目のみで、2日目以降は、どのような条件下で培養してもほとんどの場合、Gonocyteは自律的に増殖する。このことから精巣内で作られる因子によって増殖し、そのまま精子発生を続けることが考えられる。したがって、生殖細胞は、時計を持って自律的に分化する傾向があるかもしれない。また、培養後1日目は、Gonocyte増殖制御メカニズムの解除と次の制御メカニズムへ移行する時期である可能性が高い。その手助け役となっているのがTestosteroneであろう。